(见图2D)诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于对照组，表现诱导分泌IFN-γ的能力最强。
[0020]
图3-4是本发明SEQ ID No:3多肽诱导的特异性CTL增殖比较图。无论是HLA-A0201/SEQ ID No:3多肽(见图3D)还是HLA-A1101/ SEQ ID No:3多肽(见图4D)诱导的特异性CTL增殖均较HBcAg对照肽组(见图3B\4B)、HBsAg对照肽组(见图3C\4C)以及Blank组(见图3A\4A)明显增多。
[0021]
图5-6是本发明SEQ ID No:3多肽诱导的特异性CTL频率比较图。诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导后无论是HLA-A0201/ SEQ ID No:3多肽(见图OT)还是HLA-Al 101/SEQ ID No:3多肽(见图6D)诱导的特异性CTL频率均显著高于对照组肽诱导的特异性CTL频率。
[0022]【具体实施方式】:
实施例1 SEQ ID No: 3肽的合成
通过本领域公知的方法，例如多肽固相合成法，或者通过多肽合成仪，或者参照现有技术公开的方法，可以制备SEQ ID NO:3多肽片段。SEQ ID NO:3所示的多肽，委托上海吉尔生化多肽有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所述多肽的纯度高于95%，分子量与理论值相符。
[0023]SEQ ID NO:3固相多肽合成的主要操作步骤如下:
1、树脂溶胀:将Wang-Resin树脂放入反应管中加入DMF (15ml/g)，30min.2、
脱保护:弃掉DMF后加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，弃掉后再加入20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、检测:抽去哌啶溶液后，取十几粒树脂，用乙醇洗三次后加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，置于105°C?110°C加热5min。4、洗涤:采用DMF( 10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF (10ml/g)进行顺序洗涤。5、缩合:加入大于三倍剂量的保护氨基酸、活化剂HBTU，二者均用尽量少DMF溶解，加入反应管后立即加入大于十倍剂量的NMM，反应30min。6、洗涤:采用DMF (10ml/g) 一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF (10ml/g)两次进行顺序洗涤。7、重复步骤2-6操作，依次连接氨基酸(从C端至N端顺序)，最后洗涤一次:DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF (10ml/g)两次，DCM (10ml/g)两次。8、裂解:配制含94.5%TFA、2.5%H202、2.5%EDT、1%TIS裂解液，裂解120min。9、吹干洗涤:将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗涤6次后，常温风干。10、HPLC纯化:以水和乙腈做流动相，在流动相中加入0.1%的TFA，梯度从5%-85%，使用C18反相柱。
[0024]
实施例2胞内因子染色检测复合抗原肽诱导的特异性CTL效应细胞分泌IFN-γ的能力
采用密度梯度离心法从HLA-Al 101或HLA-A0201慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到的PBMC，用RPM1-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号:31800-105)重悬后，调整细胞密度至3X106/ml，接种于6孔培养板，置37°C、5%C02培养箱孵育120min，吸取未贴壁细胞即是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)，于孔中加入DC细胞培养基，置37°C、5%C02培养箱诱导，第3天进行1/3换液，第5天收获未成熟DC(树突状细胞)，加入终浓度为 20ng/ml IL_10、5ug/ml PGE_2、20ng/ml TNF-α 诱导 DC 成熟。收获成熟 DC 后，调整细胞密度至lX106/ml，按IXlO6/孔铺板，分别加入终浓度为50ug/ml的SEQ ID No:3多肽或HBsAg抗原对照肽或HBcAg抗原对照肽。实验分组为负载SEQ ID No:3多肽的实验组、负载HBsAg抗原对照组、负载HBcAg抗原对照组以及不加任何肽的Blank组。于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/mlIL-2和50ng/ml IL-7,共同孵育I周，第2周进行同样处理，期间适当补液并进行扩增，于2个周期后获得肽特异性CTL效应细胞。
[0025]
所述DC细胞培养基包括以下含量的成分:RPM1-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号:31800-105)，其中包含有3%自体血浆，1000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1000U/ml 的白细胞介素 _4 (IL-4)。
[0026]采用胞内因子染色试剂盒(美国BD公司，货号:555028)，分别检测各组负载肽的DC刺激的CTL中多肽特异性CD8+IFN- γ +Τ细胞频率，按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪进行检测，测定特异性CTL中分泌IFN- γ的T细胞所占的百分率。
[0027]
结果如图1-2所示，无论是HLA-A0201/ SEQ ID No:3多肽(见图1D)还是HLA-Al 101/SEQ ID No:3多肽(见图2D)诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其他3组，表现诱导分泌IFN-γ的能力最强。
[0028]
实施例3 CFSE标记检测HLA-Al 101或HLA-A0201阳性健康个体经复合多肽诱导刺激前后的特异性CTL效应细胞增殖
采用密度梯度离心法从HLA-Al 101或HLA-A0201健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，加入终浓度为5uM的CFSE溶液(将浓度为lOmmol/L的CFSE储备液用ImL含0.1%HAS的PBS溶液稀释制得)重悬细胞，37°C孵育30min，用培养基洗涤I次后，再用含10%人AB血清的1640培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为lX106/ml，平衡过夜后，接种于24孔板中，每孔lml，分别加入终浓度为50ug/ml的SEQ ID No:3多肽(实验组)、HBsAg (HBsAg对照肽组)、HBcAg (HBcAg对照肽组)，Blank组不加任何肽，于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/ml IL-2和50ng/ml IL-7,共同孵育I周后收集细胞进行流式细胞仪检测。
[0029]结果如图3-4所示，无论是HLA-A0201/ SEQ ID No:3多肽(见图3D)还是HLA-Al 101/ SEQ ID No:3多肽(见图4D)诱导的特异性CTL效应细胞增殖均较HBcAg对照肽组(见图3B\4B)、HBsAg对照肽组(见图3C\4C)以及Blank组(见图3A\4A)明显增多。
[0030]实施例4 Tetramer染色法检测HLA-A1101或HLA-A0201阳性健康个体经复合多肽诱导刺激前后的特异性CTL效应细胞频率。
[0031]
采用密度梯度离心法从HLA-Al 101或HLA-A0201健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，按照前述方法培养细胞后经肽[SEQ ID No:3多肽(实验组)、HBSAg(HBSAg对照肽组)、HBcAg(HBcAg对照肽组)，Blank组不加任何肽]刺激I周后，于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/ml IL-2和50ng/ml IL-7,共同孵育I周后收集细胞获得肽特异性CTL，通过PE标记HLA-A0201/ SEQ ID No:3多肽、HLA-A0201/ HBsAg^HLA-A0201/ HBcAg Tetramer 染色(或 HLA-A1101/ SEQ ID No:3 多肽、HLA-Al 101/ HBsAg, HLA-Al 101/ HBcAgTetramer染色)后，利用流式细胞仪检测肽特异性CD8+CTL 频率。
[0032]结果如图5-6所示，诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导后无论是HLA-A0201/ SEQ ID No:3 多肽(见图 5D)还是 HLA-Al 101/ SEQ ID No:3 多肽(见图 6D)诱导的特异性CTL频率均显著高于对照组肽诱导的特异性CTL频率。
【主权项】
1.一种CTL抗原复合表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。2.权利要求1的CTL抗原复合表位肽在体外制备特异性CTL效应细胞中的用途，特征在于向成熟DC加入SEQ ID No:3多肽，将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入IL-2和IL-7共同孵育，获得特异性CTL效应细胞。3.一种治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞的制备方法，其特征在于包括从HLA-Al 101或HLA-A0201慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到的PBMC，吸取外周血淋巴细胞，加入DC细胞培养基，收获未成熟DC，加入IL-1 β、PGE-2、TNF- α诱导DC成熟，向成熟DC加入SEQ ID No:3多肽，将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入IL-2和IL-7共同孵育，获得特异性CTL效应细胞。4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于所述DC细胞培养基包括以下含量的成分:RPM1-1640培养基，其中包含有1% - 3%血浆，500U/ml — 3000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、500U/ml - 3000U/ml的白细胞介素_4。5.一种权利要求3或4的方法制备的特异性CTL效应细胞。6.权利要求5的特异性CTL效应细胞在制备治疗或预防乙肝的药物中的用途。7.一种包含权利要求5的特异性CTL效应细胞的生物制剂。8.一种包含权利要求5的特异性CTL效应细胞的组合物。9.一种包含权利要求5的特异性CTL效应细胞的试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。使用CTL抗原复合表位肽激发CTL应答能力，提供有效的特异性CTL效应细胞。本发明还提供了包含所述治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞或细胞制剂的组合物或试剂盒。
【IPC分类】A61P31/20, C12N5/0783, C07K19/00, A61K39/29
【公开号】CN105037559
【申请号】CN201510504644
【发明人】刘静维, 卢戌, 王跃, 李京坡, 杨照敏, 张晓燕, 王燕飞
【申请人】北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月17日