治疗试剂的制作方法

治疗试剂的制作方法
【专利说明】治疗试剂
[0001] 本发明涉及基于与肾上腺髓质素介导的信号传导有关的细胞表面多肽的治疗试 剂以及鉴定治疗试剂的筛选测定方法。
[0002] 置量
[0003] 细胞信号传导对于存活是关键的；没有细胞信号传导，物理上或化学上隔离的细 胞要经历细胞凋亡。在癌细胞中，很多接触依赖性的过程是异常的，但是已经显示肾上腺髓 质素-介导的信号传导的接受对于肿瘤中80%细胞的存活是必需的。由于许多激素和细胞 因子结合特异性的受体，肾上腺髓质素（AM)通过称为降钙素受体样受体（CRLR)的受体来 起作用。
[0004] 生物活性的降钙素肽家族包括降钙素、糊精、两种降钙素-基因相关肽（CGRP1和 CGRP2)及肾上腺髓质素（AM)。降钙素是在哺乳动物及大量的非哺乳动物的甲状腺滤泡旁 "C"细胞中发现的32个氨基酸的肽。降钙素调节矿物质（钙和磷酸盐）的平衡。降钙素通 过作为诱导骨再吸收的破骨细胞的抑制剂起作用引起高钙血症。CGRP是由降钙素基因的组 织特异性的加工而产生的37个氨基酸的肽。降钙素是甲状腺中的主要产物，而CGRP是神 经组织中的主要产物。CGRP是有效的心血管药物而且具有与糊精结构的相似性。CGRP是 在仅仅相差3个氨基酸的两种异构体（CGRP-I和CGRP-II)中发现。
[0005] 肾上腺髓质素（AM)是52个氨基酸的降血压肽。其与CGRP具有与糊精的结构相 似性。AM在外周组织、肾上腺髓质、肺和肾中产生，并且其在局部缺血中不被调节。AM的受 体存在于多种组织中，例如，存在于中枢神经系统中的星形胶质细胞、眼内的虹膜肌、骨、血 管、心脏、肾和皮肤（Uchikawa 等人，Clin Exp Pharmacol Physiol. 2005 年 8 月，第 32 卷 (第 8 期）：第 675-80 页；Sumanas 等人，Blood. 2005 年 7 月 15 日，第 106 卷（第 2 期）： 第 534-41 页；Cornish J，Reid J Musculoskelet Neuronal Interact. 2001 年 9 月，第 2 卷（第 1 期）：第 15-24 页；Yoshihara 等人，Regul. Pept. 2005 年 4 月 15 日，第 127 卷（第 1_3 期）：第 239-44 页；Matsumoto 等人，Clin Exp Nephrol. 2004 年 11 月，第8 卷（第 4 期）：第 316_21 页；Muller 等人，Br J Dermatol.2〇〇3 年 1 月，第 148 卷（第 1 期）：第 3〇_8 页）。通常地，降钙素肽家族具有6-7个氨基酸的包含二硫腱的N-末端环状结构以及酰胺 化C-末端。
[0006] 降钙素肽家族通过G-蛋白偶联的膜受体（GPCRs)来起作用。降钙素受体的基因已 经被克隆。其与"B"家族中的通常识别调节肽（胰泌素、胰高血糖素、VIP)的GPCRs是同源 的。已经鉴定出降钙素受体的同源物：降钙素受体样受体（CRLR，也称为CL)(人：461个氨 基酸；大鼠/小鼠：463个氨基酸），并且该降钙素受体样受体与降钙素受体具有55%的同 源性（Njuki 等人，Clin.Sci?第 85 期，第 385-388 页（I"3 年）；Chang 等人，Neuron 第 11 期，第 1187-1195 页（1993 年）；Fluhmann 等人，Biochem.Biophys.Res.Comun?第 206 期， 第 341-：347 页（I"5 年）；Kapas 等人，J. Biol. Chem?第 27〇 期，第 25344_25347 页（1"5 年））。经鉴定，GPCR "A"家族的两个相关成员：RDC1和G10D分别为CGRP和AM的受体。
[0007] CRLR不能够单独地传导应答AM的信号，因为RAMP (受体活性修饰蛋白）的存在 对于引发配体的特异性、CRLR的结合与激活是必要的。RAMPs是小内源性膜蛋白族，具有 14, 000-17, OOOOKd的预定大小。RAMPs由约120个氨基酸组成，具有约100个氨基酸的大 型胞外域、单独的跨膜区和约10个氨基酸的短的胞内区。
[0008] 已经显示，CRLR可以作为CGRP受体或AM受体来实现，取决于RAMP家族的成员即 RAMPs 1-3中的哪些被表达。RAMP1、2和3含有N-末端信号肽、胞外的N-末端、靠近C-末 端的单独的跨膜区和胞浆C-末端。RAMP1-3显示了 31 %的同一性。RAMP-2和RAMP-3具有 大约30%的同一性。RAMPS可能涉及CRLR到质膜的转运。
[0009] RAMP家族的三个成员，即RAMP1、2和3,造成了如下的CRLR的不同配体的特异性：
[0010] RAMP1+CRLR = CGRP 受体
[0011] RAMP2+CRLR = AM 受体
[0012] RAMP3+CRLR = AM 受体
[0013] RAMP1使质膜上的CRLR呈现为末端糖基化的、成熟的糖蛋白和CGRP受体，而 RAMP2和RAMP3使CRLR呈现为不成熟的、核心糖基化的ADM受体（McLatchie等人，1998 年）。
[0014] 本发明涉及通过对RAMP-CLRL相互作用的影响能力来鉴定治疗试剂。这样的试剂 为尤其是癌症治疗的靶点。
[0015] 发明简沐
[0016] 在本发明的第一方面，提供了能够结合到或是调节一种或多种RAMP蛋白（受体活 性修饰蛋白）的降钙素受体样受体（CRLR)的作用的试剂，所述的一种或多种RAMP蛋白选 自：（i)RAMP-3、（ii)RAMP-2 和（iii)RAMP-l 蛋白。
[0017] 在一种实施方案中，所述试剂结合至RAMP蛋白的胞外域。在一种特定的实施方案 中，所述RAMP蛋白是人的RAMP蛋白。尤其是，所述试剂可以是能够调节RAMP-3和CRLP的 相互作用。
[0018] 在一种实施方案中，本发明的制剂与至少一种选自如下的配体结合：
[0019] (a) 1-31个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括在如图3中所示的人RAMP-3蛋白的 第1位到第31位的连续氨基酸序列中所包含的连续氨基酸残基的序列；
[0020] (b) 1-15个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括如图3中所示的人RAMP-3蛋白的第 32位到第46位的连续氨基酸序列中所包含的连续氨基酸残基的序列；和
[0021] (c) 1-53个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括如图3中所示的人RAMP-3蛋白的第 47位到第99位的连续氨基酸序列中所包含的连续氨基酸残基的序列。
[0022] 在一种实施方案中，所述试剂与至少一种选自如下的配体结合：
[0023] (a) 1-32个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括如图3中所示的人RAMP-3蛋白的第 1位到第32位的连续氨基酸序列中所包含的连续氨基酸残基的序列；
[0024] (b) 1-14个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括如图3中所示的人RAMP-3蛋白的第 33位到第46位的连续氨基酸序列中所包含的连续氨基酸残基的序列；
[0025] (c) 1-53个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括如图3中所示的人RAMP-3蛋白的第 47位到第99位的连续氨基酸序列中所含的连续氨基酸残基的序列。
[0026]所述肽段通常为5-15个氨基酸的长度。肽段（a)、（b)和（c)各自独立地具有5、 6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基。它们可以具有5-13个、5-11个或5-9个残基 例如13个氨基酸残基、11个氨基酸残基或9个残基。也在本发明范围之内的是（各自独立 地）具有5、6、7、8、10、12、14或15个氨基酸残基的肽段（a)、（b)和（c)。更多氨基酸残基 数目的肽段仏)、〇3)和（〇)可能是包含17、18、19、20、25或30个残基。肽段（(3)可以具有 的更多氨基酸残基数目包括，例如31、32、35、40、45、50和53个氨基酸残基。本发明的试剂 可以结合至包含至少一个本文所述的肽段的抗原表位上。
[0027] 肽段（b)可包括全部或部分推定的CRLR结合结构域。所述试剂可以结合至人的 RAMP-3片段，该片段是通过使用人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和人钙蛋白酶-1来酶消化 RAMP-3细胞外区域而制备的。
[0028] 本发明公开内容中还包括结合到至少一种选自如下的肽段上的试剂：
[0029] (a) 1-15个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括在以下氨基酸序列中包含的连续氨 基酸残基的序列：
[0030] GCPRAGGCNE TGMLERLPLC GKAFADMMGK VDVWKWCNL；
[0031] (b) 1-15个氨基酸残基的肽段，所述肽段包括在以下氨基酸序列中包含的连续氨 基酸残基的序列：
[0032] ESFT NCTEMEANW GCYWPNPLAQ GFITGIHRQF FSNCTVDRVHLEDPPDEVL〇
[0033] 上面示出的序列包含在RAMP-3蛋白中，所述RAMP-3蛋白包括例如图3的氨基酸 序列。
[0034] 本发明的试剂任选地具有下面的两种能力的一种或多种：
[0035] 1、能够抑制表达所述RAMP和CRLR蛋白的SW-13细胞至少10%的增殖，其中所述 增殖是使用MTT细胞增殖试验来测量的；
[0036] 2、与缺乏所述试剂而给药肾上腺髓质素相比较，就肾上腺髓质素的给药，能够抑 制人MG63骨肉瘤细胞中cAMP至少约15%的生成。
[0037] 所述试剂可以是能够结合至RAMP蛋白例如RAMP-3上。在一种实施方案中，所述 试剂与RAMP-3的胞外域相结合，例如含有图3的氨基酸残基1-99的序列。
[0038] 在此公开的数据可以表明，无论是在RAMP-3和CRLR之间相互作用的抑制剂或者 是在RAMP-3/CRLR结合复合物及配体如肾上腺髓质素之间相互作用的抑制剂均可以用于 预防癌症或血管生成。这样的制剂还可以用于治疗糖尿病，包括缓解糖尿病症状例如糖尿 病微血管病。
[0039] 根据本发明的一个方面，提供了调节多肽对于降钙素受体样受体（CRLR)功能的 作用的试剂，其中所述多肽选自：
[0040] i)多肽或其变体，由图1、2或3所示的核酸序列组成的核酸分子编码；
[0041] ii)由核酸分子编码的多肽，所述核酸分子在严谨条件下杂交至如以上（i)所定 义的核酸分子并调节CRLR功能；和
[0042] iii)含有核酸的多肽，所述核酸由于遗传密码而与⑴和（ii)中定义的核酸序列 是简并的，其特征在于，所述试剂是作为药物使用。
[0043] 本文所使用的"CRLR的功能或活性"是指CRLR的任意生物学活性。具体"功能" 包括在应答配体中的CRLR激活，所述配体的例子包括肾上腺髓质素（AM)和CGRP。应答AM 或CGRP的CRLR激活通常引起cAMP的表达以及其它第二信使系统的激活。
[0044] 由于配体如AM或CGRP会结合至本发明的多肽，即RAMP蛋白，因此，只有当所述多 肽与CRLR相结合时，本发明的试剂可用于调节例如干扰RAMP蛋白与CRLR的结合。通过干 扰RAMP蛋白例如RAMP-1、RAMP-2和RAMP-3与CRLR的结合，可以影响例如降低或甚至是 阻止CRLR的激活。所述的干扰可以是例如直接或间接地阻断位于RAMP蛋白上、CRLR上和 /或RAMP/CRLR复合物内的配体的结合位点的结果。在一种实施方案中，所述试剂结合至 RAMP-3蛋白的胞外域的氨基酸序列，该氨基酸序列不是CRLR结合区域。在一种选择性的 实施方案中，所述试剂可以是激动剂，这就是说，模拟所述RAMP/CRLR受体与配体的相互作 用，并且因此可以导致CRLR受体的兴奋以及由受体产生的增加的或异常的信号传导。
[0045] 在一种优选的实施方案中，所述试剂是抗体产品。在一种实施方案中，所述抗体产 品结合至RAMP-3蛋白。所述抗体可以特异性地结合至RAMP-3。
[0046] 本发明公开的范围内包括用作药物的所述试剂。
[0047] 在本发明的进一步的方面，当所述试剂为例如抗体产品或蛋白如融合蛋白时，提 供适合于表达本发明试剂的载体。本发明还提供了已经以在此所述的载体转化或转染的细 胞。
[0048] 在本发明的进一步的方面，提供了制备本文所述的试剂例如抗体的方法。
[0049] 若干实施例的详细说明
[0050] 在本说明书中使用以下术语和缩略语：
[0051] 定义
[0052] 除非另外指出，技术术语是根据其常规的用法来使用。分子生物学中常见术语的 定义可以在 Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press 出版，1994 年（ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（编辑），The Encyclopedia of Molecular Biology， Blackwell Science Ltd 出版，1994 年（ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A.Meyers(编 辑），Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers，Inc.出版，1995年（ISBN 1-56081-569-8)中找出。免疫学领域的技术人员 已知的定义和附加信息可以在例如Fundamental Immunology，W. E. Paul编辑，第四版， Lippincott-Raven Publishers，1999 年中找出。
[0053] 抗体片段（与特异性抗原结合的片段）：已经定义了抗体的不同片段，包括Fab、 (Fab' )2、Fv、dsFV、单链Fv(scFv)和域抗体包括单域抗体。将这些抗体片段定义如下： (l)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，由所述片段是用木瓜蛋白酶消化整个 抗体或是通过基因工程的等效方法来得到完整的轻链和重链的一部分；(2)Fab'，抗体分 子片段，通过以胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原以产生完整的轻链以及重链的一部分；每 个抗体分子均获得两个Fab'片段；（3) (Fab' )2，抗体片段，通过以胃蛋白酶处理整个抗体 但不经过随后的还原或基因工程等效方法来获得；(4) F (Ab') 2，通过二硫键将两个FAb' 片段连在一起形成的二聚体；(5) Fv，基因工程产生的片段，包含表达为两条链的轻链可变 区和重链可变区；dsFV，其为通过二硫键连接的轻链可变区和重链可变区，和（6)单链抗体 ("SCA")，基因工程产生的分子，包含通过适宜的多肽接头如基因融合的单链分子来连接的 轻链可变区、重链可变区。单链抗体还可以称为单链可变片段（scFv)。
[0054] 单域抗体是其互补决定区为单域多肽一部分的抗体。其例子包括但不限于重链抗 体、轻链天然缺失抗体、衍生自常规的4链抗体的单域抗体、工程抗体和非衍生自抗体的单 域支架。单域抗体可以是任何现有技术中的或任何未来的单域抗体。单域抗体可以衍生自 任何种类的包括但不限于鼠、人、骆驼、骆马、山羊、兔子、牛。单域抗体可以是称为无轻链的 重链抗体的天然存在的单域抗体。例如，这样的单域抗体公开于WO 9404678中。制备这些 片段的方法均是现有技术中常规的。
[0055] dAB (域抗体）是抗体的最小功能性结合单元，其对应于人抗体的重链（VH)或轻链 (VL)的可变区。域抗体具有约13kDa的分子量，或者少于整个抗体1/10的大小。域抗体可 包括结合至两个治疗祀点的dAbs。这些祀点包括：IgG_样分子、聚乙二醇化的（PEGylated) 融合蛋白和抗血清白蛋白的融合蛋白。在所述IgG-样抗体中，两个可变区结合至IgG每条 臂上的两个治疗靶点。
[0056] 细胞系/细胞培养物"细胞系"或"细胞培养物"表示更高的真核细胞的体外生长 或保持。理解的是，细胞的子代可以与亲代细胞不完全相同（形态学上、基因型上或表型 上）。"异源的"是指衍生自基因型上不同于与其比较的其余主体的主体。例如，多核苷酸 可以通过基因工程技术置入衍生自不同来源的质粒或载体，并且其是异源的多核苷酸。从 其天然编码序列中除去的启动子以及有效地连接到未发现有天然连接的编码序列上的启 动子是异源启动子。"分离的"多核苷酸或多肽是基本上不含与其天然结合的物质。基本上 不含是指不含有至少50 %，优选为至少70 %，更优选为至少80 %，而且甚至更优选为至少 90 %的与其天然结合的物质。
[0057] 互补性决定区（⑶R):⑶Rs是在抗体分子各个轻链可变区（VL)和重链可变区 (VH)之内的三个高度可变区，所述抗体分子形成与所结合抗原的三维结构互补的抗原结 合表面。从重链或轻链的N-末端开始，这些互补性决定区是分别表示为"⑶R1"、"⑶R2" 和"CDR3"。CDRs涉及抗原-抗体的结合，并并且所述CDR3包含有专门用于抗原-抗体结 合的独特区域。因此，抗原结合位点可以包括六个CDRs，该CDR区域包括各个重链和轻链 可变区（V region)。CDR区域内单个氨基酸的变更可以改变抗体对特异性抗原的亲合力 (参见Abbas 等人，Cellular and Molecular Immunology，第4 版，143-5,2000 年）。例 如由 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunologic Interest，（免疫的蛋白质序 列）U.S. Department ofHealth and Human Services，1983 年已经精确定义了 CDRs 的位 置。Ig的轻链和重链各自具有三个CDRs，分别定义为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3以及H-CDR1、 H-CDR2、H-CDR3。通过定义，轻链的 CDRs 通过 24 和 34 位（L-CDR1)、50 和 56 位（L-CDR2)、 89和97位（L-CDR3)的残基来结合；重链的CDRs通过31和35b位（H-CDR1)、50和65 位（H_CDR2)、95 和 102 位（H-CDR3)的残基来结合，使用由 Kabat 等人，（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda(NIH 公开 号91-3242)所描述的编号规定。
[0058] 参考 Kabat，E. A 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，MD (1987)和（1991)的编号方案。 在这些纲要中，Kabat列出了各个亚类的抗体的许多氨基酸序列，并且列出了所述亚类中 各个残基位置的最常存在的氨基酸。Kabat使用了将残基数分配到所列出序列中的各个 氨基酸的方法，并且这种用于分配残基数的方法已经成为本领域的标准。就本发明的目的 而言，将残基数分配给未包括在Kabat的纲要中的侯选抗体的氨基酸序列，然后进行以下 步骤。通常地，所述侯选序列是用Kabat中的任何免疫球蛋白序列或任何共有序列来排列 (aligned)。排列可以通过手工进行，或者通过使用常规认可的电脑程序由电脑进行；这种 程序的例子是本说明书中所讨论的排列程序2。排列可以通过使用对大多数Fab序列是常 见的一些氨基酸残基来促进。例如，轻链和重链通常各自具有两个具有相同残基数的半胱 氨酸；在VL域中，所述两个半胱氨酸通常在残基数23和88上；而在VH域中，所述两个半胱 氨酸通常在残基数22和92上。框架残基通常地但并不是总是具有大约相同数量的残基， 然而，所述CDRs会在大小上改变。例如，在来自侯选序列的CDR比Kabat中排列的序列中 CDR长的情况下，通常在残基数上加后缀以表明插入另外的残基（参见，例如图5中的残基 lOOabcde)。对于侯选序列而言，例如，所述候选序列以Kabat序列来排列残基34和36但 是在它们之间没有以残基35来排列的残基，则简单地将数目35不分配给残基。
[0059] Q)R和FR的残基还根据结构定义来确定（如在Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196 : 901-917(1987)中）。当这两种方法导致⑶R的鉴定略有不同时，优选结构定义，但是由序 列定义方法所鉴定的残基被认为是对于确定以哪种框架残基输入共有序列而言重要的FR 残基。
[0060] 恒定区：抗体分子赋予效应物功能的部分。在本发明的公开内容中，使用的变异抗 体可以包括来源于人免疫球蛋白类的恒定区。所述重链恒定区可以选自五个种型中的任何 种型：a、S、e、丫或y。不同亚类的重链（如IgG亚类的重链）是造成不同效应物功能 的原因。因此，通过选择所期望的重链恒定区，可以制得具有所期望的效应物功能的人源化 抗体。轻链恒定区可以是k或A型。
[0061] 表位：抗原上的位点是通过试剂来识别如通过氨基酸序列的特异性来确定。如果 例如在竞争性结合试验中测量到两种试剂中的每种试剂竞争地抑制（阻断）另一种试剂 结合至所述抗原，则该两种试剂被认为是结合至相同的表位（参见，例如Junghans等人， Cancer Res. 50 :1495-1502,1990)。选择性地，如果降低或消除一种抗体结合的所述抗原中 的大多数氨基酸的突变，也降低或消除另一种