评估系统MFEprimer设计多重PCR引物，用于 扩增目的基因片段[1°]。引物序列详见表1。
[0036] 表1扩增目的片段的引物
1. 4病毒核酸提取 分别将接毒细胞悬液及临床匀浆样品反复冻融3次后，各取200 y L，参照RNA & DNA 提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒核酸（RNA和DNA)，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，一 20 °C保存备用。
[0037] 反应体系及条件优化 单一病毒PCR/RT-PCR反应。反应体系为25yL，2Xl st印Buffer 12.5 yL、上下游 引物各lyL，模板各1 yL，PrimeScript One Step Enzyme MixlyL，RNase free H208. 5 yL。反应程序：50°C 40min;95 °C 5 min;95 °C30 s;57°C30 s;72 °C 30s，共进行35 个循环；72°C 10min。取5. OyLPCR/RT-PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳测定。 [0038] 产物的鉴定 将上述6种病毒的PCR/RT-PCR扩增片段胶回收产物与pMD19-T载体16 °C连接过夜， 将连接产物转化至T0P10感受态细胞，经Amp、IPTG、X-gal筛选，挑取单个白色菌落扩大 培养，送阳性菌液至上海英骏生物技术有限公司测序。
[0039] 六重PCR方法反应条件的优化 对六重PCR反应条件，包括退火温度（51~60 °C )，引物量进行优化，以确定最佳反 应条件。50 yL四重PCR反应体系：2X1 stepBuffer 25 yL、模板各1 yL，上下游引 物量（〇.5iiL _2iiL )，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2yL，add RNase free H20 to 50 yL。PCR 反应条件：5(TC 40min ;95 °C 5 min ;94 °C 30 s ;( 51 ~60 °C ) 30 s ;72 °C 30s，共进行35个循环；72 °C延伸10 min。取5.0 yL PCR产物于1.5%琼脂糖进行 凝胶电泳测定。
[0040] 六重PCR特异性检测 通过建立的六重PCR方法分别对分别以PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV、PEDV、A coJi 核酸为模板进行扩增，检测该方法是否具有特异性。
[0041] 六重PCR敏感性检测 将提取的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，用灭 菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板分别进行PCR反应。
[0042] 六重PCR对临床病料的检测 利用已建立的六重PCR方法对收集于贵州省内的共48份临床病料进行检测，分别取 病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000 r/mim离心5 min，各取200 yL，参照DNA&RNA提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒核酸 (DNA和RNA)，其余操作按照前述的方法进行。
[0043] 结果 2. 1 PCR产物的鉴定 将 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV 和 SIV 单一 PCR/RT-PCR 产物连接 pMD19-T 载体后，转 化T0P10感受态细胞，送上海英骏生物技术有限公司测序。结果表明，扩增片段分别为各 自病毒的特异性基因片段。
[0044] 六重PCR反应条件优化 六重PCR在50 yL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物量PRV、PCV2各0. 5yL (5 ymol ? L 3、PRRSV 各 0? 8 y L (8 ymol ? L 3、CSFV 各 1 y L (10 ymol ? L 3、PPV 各 0.7yL (7ymol吨1)』^各1.5yL (15ymol吨1)。按照优化的PCR反应条件，对PRV、 ?(^2、？1?1?￥、05?￥、？?￥、51￥的核酸混合模板进行？〇?，扩增出了约192&口、255 &口、36牝口、 530bp、759bp和981bp的特异性片段，与预期扩增目的片段大小相符，退火温度为56. 5°C 时，六重PCR电泳效果最好（图1)。六重PCR最佳反应程序：反应体系为2X1 step Buffer 25 yL、模板各 1 yL，上下游引物量 PRV、PCV2 各 0.5yL、PRRSV 各 0.8yL、CSFV 各 lyL、 PPV 各 0? 7yL、SIV 各 1. 5yL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2yL，add RNase free H20 to 50 yL。最佳反应条件为：50°C 40min;95 °C 5 min;94 °C30 s;56.5°C 30 s;72 °C 30s，共进行35个循环；72 °C延伸10 min。
[0045] 特异性检测 用已确定的六重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PEDV、A cWi、正常组织模板 均未扩增出条带，而PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV模板均扩增出与目的片段大小相符 的特异性条带（图2)。
[0046] 敏感性检测 对病毒的核酸进行10倍梯度稀释，在建立的六重PCR检测方法反应条件下进行扩增， 观察其敏感性。研究发现：各种病毒的最低检测量分别为PRV18pg、PCV22pg、PRRSV26pg、 CSFV48pg、PPV86pg、SIV32pg(图 3)。
[0047] 临床样本检测 多重PCR对临床病料的检测 48份临床病料检测结果表明，PRV感染阳性率为13% (6/48)，PCV2感染阳性率为42% (20/48)，PRRSV感染阳性率为38% (18/48)，CSFV感染阳性率为21% (10/48)，PPV感染阳 性率为8. 3% (4/48)，SIV感染阳性率为40% (19/48);二重感染阳性率达31% (15/48);三 重感染阳性率达21% (10/48);四重感染阳性率达6. 3% (3/48);五重感染阳性率达2. 1% (1/48);六重感染阳性率为0。结果与单项RT-PCR方法检测符合率为100%。
【主权项】
1. 一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检测试剂盒，其特征在于： 包含 Partl 和 Part2, Parti :2 Xl St印 Buffer 25-40 微升，RNase Free H2O 7. 5-15 微升， PrimeScript One Step Enzyme Mix 2-4 微升，阳性对照；Part2 :Solution A 200-400 微 升，Solution B 75-150 微升，Rinse A 500-1000 微升，Rinse B 800-1600 微升，Elution Buffer 50-10 微升，Spin Column 1-2 支，Collection Tube 2-3 支，薄壁 PCR 管 1-2 支，上 样缓冲液1-2微升。2. 根据权利要求1所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒，其特征在于=Partl零下20°C保存，Part2室温保存。3. 如权利要求1或2所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR 检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包含以下步骤： (1) 取病料样本，加入离心管中；后加入Solution A，振荡混匀后，室温放置； (2) 加入Solution B，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到l#Collection Tube中，加异丙醇和冰乙酸混匀； (3) 将Spin Column安置于2#Collection Tube上；将步骤（2)的上清液转移至Spin Column中，离心，弃滤液； (4) 将Rinse A加入至上述Spin Column中，室温静置，离心，弃滤液； (5) 将Rinse B加入至Spin Column中，离心，弃滤液；再次离心； (6) 将Spin Column安置于离心管上，在Spin Column膜的中央处加入灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR 扩增：2 Xl Step Buffer、PrimeScript One Step Enzyme Mix、上下游引物 PRV、PCV2、上下游引物PRRSV、上下游引物PPV、上下游引物CSFV、上下游引物SIV、模板 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 和 RNase Free H2O 进行 PCR 扩增反应； (8) 取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于I X TAE琼脂糖凝胶中电 泳检测，紫外灯下观察结果，即可。4. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：首次使用前，在Rinse A中添加12. 5mL的100%乙醇；在 Rinse B中添加31. 5mL的100%乙醇。5. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的PRV病毒gB基因的上下游引物： Fl :5，- GACCACGCGGTCAATGTCG -3，， Rl : 5' - ATGGTGGAGGTGCCCG -3'，片段 192bp。6. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的PCV2病毒0RF2基因上下游引物： F2：5, -TGGGGGATTGTATGGCGGG-Sr, R2:5' -GGCGGTGGACATGCTGAGAT-3'，片段 255bp。7. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的PRRSV病毒0RF6基因上下游引物： 卩3:5' -TTCTGCCACCCAACACGAGG-3，， R3:5，-GGCCGACTGCTAGGGCTTTT-3'，片段 364bp。8. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的CSFV病毒C基因上下游引物： F4:5' -ACCTCGCAGAACTGCACTT-3'， R4 :5' -GTCAGTAGTTCGACGTGAGCAG -3 '，片段 530bp。9. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检 测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的PPV病毒NSl基因上下游引物： -TGATGCTGTCACACAGGTGAA-Sr , R5 :5' -GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3'，片段 759bp。10. 根据权利要求3所述的一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR 检测试剂盒的使用方法，其特征在于：设计的SIV病毒M基因上下游引物： F6:5' - AGCGCTATGTTGACAAAATGACC -3'， R6:5，-TTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGG-3'，片段 981bp。
【专利摘要】本发明公开了一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1？Step？Buffer？25-40微升，RNase？Free？H2O？7.5-15微升，PrimeScript？One？Step？Enzyme？Mix？2-4微升，阳性对照；Part2：Solution？A？200-400微升，Solution？B？75-150微升，Rinse？A？500-1000微升，Rinse？B？800-1600微升，Elution？Buffer？50-10微升，Spin？Column？1-2支，Collection？Tube？2-3支，薄壁PCR管？1-2支，上样缓冲液1-2微升。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105039603
【申请号】CN201510535905
【发明人】汤德元, 王红光, 罗险峰, 曾智勇, 黄涛, 王洪光, 韦冠东, 龙冬梅
【申请人】贵州大学, 贵州省动物疫病预防控制中心
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月28日