一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检测试剂盒 及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着现代养猪业规模化和集约化程度越来越高，猪群发生多种病原混合感染和继 发感染的情况越来越普遍，猪病的复杂程度及其危害也与日倶增。目前，猪呼吸道疾病是影 响养猪业发展的主要疾病，也是我国规模化猪场的常发病、多发病，已经引起人们的普遍重 视，给我国养猪业带来极大的经济损失。在猪场常发生的各类病毒性呼吸道疾病中，PRV、 PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV等是较为多见的病原。这些病毒引起的猪呼吸道疾病主要 以发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、眼鼻分泌物增多、食欲减退、迅速消瘦等为特征；同时PRV、 PCV2、PRRSV、CSFV和PPV还是引起妊娠母猪发生流产，产死胎、木乃伊胎、无活力弱仔、畸形 胎，少仔和不育的猪繁殖障碍性疾病的主要病因之一；怀孕母猪感染SIV时，也可引起繁殖 障碍。PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV均可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体 对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，导致疫病复杂化，病症加重。
[0003] 目前，猪病毒性疾病已严重危害世界规模化养猪业，我国许多规模化猪场均不同 程度受到猪病毒性呼吸道疾病的威胁，PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV是主要的病毒性呼 吸道疾病病原，同时都还可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体对外界的抵抗能力， 引起继发性混合感染，使得疾病的诊断难度越来越大，因此快速、准确地诊断出发病原因对 于及时并有针对性地对发病猪场采取药物治疗或免疫预防措施，对降低养猪生产中的疾病 风险具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是：提供一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和 SIV的mPCR检测试剂盒及其检测方法，已解决现有技术的不足。
[0005] 本发明的技术方案是：一种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR 检测试剂盒，包含Parti和Part2, Parti :2X1 St印Buffer 25-40微升，RNase Free H20 7.5-15微升，卩1'；[11163(31'1。1:0116 3七6。￡112：71116]\^12-4微升，阳性对照；？&1^2:3〇1111:;[011八 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升， Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1-2支，Collection Tube 2-3支，薄壁PCR管 1-2支，上样缓冲液1-2微升。
[0006] Part 1零下20 °C保存，Part2室温保存。
[0007] -种快速鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR检测试剂盒的使用方法， 包含以下步骤： (1)取病料样本，加入离心管中；后加入Solution A，振荡混匀后，室温放置； (2) 加入Solution B，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到l#Collection Tube中，加异丙醇和冰乙酸混匀； (3) 将Spin Column安置于2#Collection Tube上；将步骤（2)的上清液转移至Spin Column中，离心，弃滤液； (4) 将Rinse A加入至上述Spin Column中，室温静置，离心，弃滤液； (5) 将Rinse B加入至Spin Column中，离心，弃滤液；再次离心； (6) 将Spin Column安置于离心管上，在Spin Column膜的中央处加入灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR 扩增：2 XI Step Buffer、PrimeScript One Step Enzyme Mix、上下游引物 PRV、PCV2、上下游引物PRRSV、上下游引物PPV、上下游引物CSFV、上下游引物SIV、模板 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 和 RNase Free H20 进行 PCR 扩增反应； (8) 取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1 XTAE琼脂糖凝胶中电 泳检测，紫外灯下观察结果，即可。
[0008] 首次使用前，在Rinse A中添加12. 5mL的100%乙醇；在Rinse B中添加31. 5mL 的100%乙醇。
[0009] 设计的PRV病毒gB基因的上下游引物： F1 :5，- GACCACGCGGTCAATGTCG -3，， R1 : 5' - ATGGTGGAGGTGCCCG -3'，片段 192bp。
[0010] 设计的PCV2病毒0RF2基因上下游引物： F2：5, - TGGGGGATTGTATGGCGGG -3r , R2:5' -GGCGGTGGACATGCTGAGAT-3'，片段 255bp。
[0011] 设计的PRRSV病毒0RF6基因上下游引物： 卩3:5' -TTCTGCCACCCAACACGAGG-3，， R3:5，-GGCCGACTGCTAGGGCTTTT-3'，片段 364bp。
[0012] 设计的CSFV病毒C基因上下游引物： F4：5, - ACCTCGCAGAACTGCACTT -3r , R4 :5' -GTCAGTAGTTCGACGTGAGCAG -3 '，片段 530bp。
[0013] 设计的PPV病毒NS1基因上下游引物： -TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3r , R5 :5' -GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3'，片段 759bp。
[0014] 设计的SIV病毒M基因上下游引物： F6:5' - AGCGCTATGTTGACAAAATGACC -3'， R6:5，-TTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGG-3'，片段 981bp。
[0015] 本发明的独特效果在于：本发明建立了 PRV、PCV2、CSFV、SIV等病毒的四重PCR检 测方法，PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV等病毒的五重PCR检测方法以及PRV、PCV2、PRRSV、 CSFV、PPV、SIV等病毒的六重PCR检测方法，实现了上述几种病毒的同时并同步检测。
【附图说明】
[0016] 图 1 为 PRV，PCV2, PRRSV，CSFV，PPV，SIV 六重 PCR 退火温度优化； 图 2 为 PRV，PCV2, PRRSV，CSFV，PPV，SIV 六重 PCR 的特异性试验； 图 3 为 PRV，PCV2, PRRSV，CSFV，PPV，SIV 六重 PCR 的敏感性试验。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 : 本试剂盒分试剂PartI与PartII两部
+ 1使用时请置于冰盒上使用。
[0018] +2含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤，请立 即到医院进行处理。
[0019] * 3首次使用前，请在Rinse A添加12. 5mL的100%乙醇，混合均匀；请在Rinse B 添加31. 5mL的100%乙醇，混合均匀。
[0020] * 4准备异丙醇（1%冰乙酸）:在99mL的异丙醇中加入lmL冰乙酸，混合均勾，应于 室温密闭保存。操作时应戴上双层手套 2试剂盒保存期：6个月 操作方法 1病料模板核酸（RNA和DNA)的提取 操作前，提前把所需移液器、tip头（全用RNA酶处理后的tip头）、试剂盒、一次性手 套、异丙醇（1%冰乙酸）等放于工作台，紫外灯照射30min。操作时全部在工作内完成，且带 双层手套。
[0021] (1)取200uL上述病料样本，加入1.5mL离心管(可用一般EP管）中。
[0022] (2)加入200uL的SolutionA，剧烈振荡混匀后（用力在手上拍打)，室温放置 5min〇
[0023] (3)加入75uL的Solution B，混合均勾后，室温放置5min。12000rpm离心5min。
[0024] (4)将上清液转移到新的Collection Tube (2mL,试剂盒中提供）中，加250uL异 丙醇（1%冰乙酸)，上下颠倒混匀。
[0025] (5)将试剂盒中的Spin Column安置于另一新的Collection Tube(试剂盒提供） 上。
[0026] (6)将上述操作（4)的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心lmin，弃滤 液。（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心lmin) (7)将 500uL 的 Rinse A 加入至 Spin Column 中，室温静置 lmin，12000rpm 离心 lmin， 弃滤液。
[0027] (8)将 800uL 的 Rinse B 加入至 Spin Column 中，12000rpm 离心 lmin，弃滤液。 (备注：首次使用需确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇） (9)再次进行12000rpm离心lmin。
[0028] (10)将Spin Column安置于新的1. 5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入50uL的灭菌蒸馏水（RNase Free)或Elution Buffer，室温静置lmin。
[0029] (11) 12000rpm 离心 lmin，洗脱病毒 RNA/DNA。
[0030] 扩增 最佳反应体系： 2X1 Step Buffer 25)^L； PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 u L； 上下游引物PRV、PCV2 各0. 5ML; 上下游引物PRRSV 各0. 8ML; 上下游引物PPV 各0. 7ML; 上下游引物CSFV 各1ML; 上下游引物SIV 各1.5ML; 模板PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV各 1MLRNase Free H20 7)^L〇
[0031] 反应程序：5(TC 40min ;94°C 5min ;94°C 30s，56. 5°C 30s，72°C 45s，35cycles ; 72〇C lOmin. 3结果判定 取5 y L PCR产物及5 y L阳性对照分别与1 y L上样缓冲液混合均匀后，于2%的 1XTAE琼脂糖凝胶中电泳检测（85V 50 min)，紫外灯下观察结果。
[0032] 若出现192bp大小条带，则检测样品中含有PRV ;若出现255bp大小条带，则检测 样品中含有PCV2 ;若出现364bp大小条带，则检测样品中含有PRRV ;若出现530bp大小条 带，则检测样品中含有CSFV ;若出现759bp大小条带，则检测样品中含有PPV ;若出现981bp 大小条带，则检测样品中含有SIV。若同时出现几条带，则检测样品中同时含相应的几种病 毒，即表现为混合感染。
[0033] 实施例2 : 1材料与方法 1. 1病毒、质粒及菌株 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV系贵州省动物疫病研究室鉴定并传代保存；SIV系从病料 中获得；PMD19-T、Vector购自大连宝生物公司；；大肠杆菌感受态ToplO由贵州省动物疫 病研究室制备和保存。
[0034] 主要试剂及仪器 分子量标准物DL2000 Marker购自大连宝生物公司；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA & RNA Extraction Kit Ver. 4. 0购自大连宝生物工程有限公司；E. Z. N. A. TM Gel Extraction Kit (50)胶回收试剂盒系OMEGA公司产品；普通质粒小提试剂盒为 TIANGEN公司产品；异丙醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂。Icycler Thermal cycler型 PCR仪为BIO-RAD公司产品。
[0035] 引物设计 参照NCBI中PRVgB(AF257079)、PCV2 0RF2 (NC_005148)、PRRSV0RF6 (NC_001961)、CSFVC(AY805221)、PPVNS1 (NC_001718)、SIVM(⑶086140)等基因序列，应用多重PCR 引物设计系统Mpprime和多因素引物特异性