一种检测辣椒脉斑驳病毒的rt-lamp引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种检测辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 辣椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus，PVMV)属马铃薯Y病毒科 (Potyviridae)马铃薯Y病毒属（Potyvirus)成员，由姐虫非持久方式传播，可以通过病株 汁液和机械摩擦等方式传播。该病毒主要在非洲国家报道侵染辣椒引起严重病害，随后阿 富汗、印度、韩国、我国台湾等多个亚洲国家和地区也陆续报道了该病毒的发生。2005年， 在我国北京检测到该病毒，其后在湖南、陕西、海南、广西和广东等多个省份也发现辣椒脉 斑驳病毒。田间病株症状主要表现为叶脉扭曲，脉间褪绿成绿脉带和叶片普遍出现斑驳，严 重时叶片变小、畸形、提早脱落，病果褪绿花斑、畸形等，严重影响到辣椒的产量和品质。目 前，检测PVMV的方法主要是反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)方法和血清学（ELISA)方法。 RT-PCR检测方法主要包括：根据已知病毒保守序列设计RT-PCR引物，提取病样中的总RNA， 以其中的病毒基因组RNA作为模板，在PCR管中加入逆转录酶、模板、RT-PCR反应成分，PCR 仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法特异、较灵敏，但需要购买专业仪器 PCR仪，且较费时。目前利用RT-PCR检测病毒需要6小时左右。ELISA方法是将抗原（病 毒）包被在固相支持物上，再依次加入病毒的抗体（一抗）和二抗，使免疫反应在固体表面 进行，并借助结合在二抗上酶与底物的反应所产生的颜色来进行检测。它具有操作简单的 优点，但需要专门制备病毒的特异性抗血清或单克隆抗体，且相对分子生物学技术该方法 灵敏度不高，存在一定的假阳性率。
[0003] 环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP)技术，是利 用能识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚 合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。LAMP呈瀑布式扩增，其扩增效率 非常高，反应非常灵敏；利用识别靶序列上的6~8个特异性位点，其特异性很高；反应在 60~65°C恒温下进行，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；整个检测反应只 需1. 0~1. 5h，检测周期短。因此，该方法具有检测速度快、灵敏度高及不需要昂贵的专业 仪器等优点。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种检测辣椒脉斑 驳病毒的RT-LAMP引物。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种含有上述RT-LAMP引物的辣椒脉斑驳病毒 RT-LAMP检测试剂盒。
[0006] 本发明的第三个目的在于提供一种利用上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒 检测辣椒脉斑驳病毒的方法，该方法快速、灵敏、简便。
[0007] 本发明的第四个目的在于提供上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒的应用。
[0008] -种检测辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP引物，包括一对外侧引物F3和B3以及一对 内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
[0009] F3:CTTGAATGGCTTAATGGTTTG；
[0010] B3:CGCTTCTCAATGTACGCT；
[0011] FIP:CTCTTCACCATCAACCATCACCCTGTATAGAAAATGGGACATCGC；
[0012] BIP:ATCCAATTAAGCCATTGATTGACCATACTGAAATGCGCCATGA；
[0013] -种辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含上述RT-LAMP引物；
[0014] 所述的辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒，优选包含如下组分：上述RT-LAMP引 物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料；
[0015] 所述的RT-LAMP反应液优选包含如下组分：Tris-HCl (pH8. 8)40mM ;KC1 20mM ; MgS04 16mM ; (NH4)2S04 20mM ;Tween20 0? 2% (w/w) ;Betainel. 6M ;dNTPs每种2. 8mM ;
[0016] 所述的酶溶液优选为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液；
[0017] 所述的核酸荧光染料优选为荧光目视检测试剂（容研生物科技（中国）有限公司 产品）；
[0018] -种检测辣椒脉斑驳病毒的方法，包含如下步骤：
[0019] 以待测样品的RNA为模板，利用RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP 扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳 性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应；
[0020] 所述的RT-LAMP扩增反应的反应体系优选为25 yL反应体系，包含如下组分： RT-LAMP反应液 12. 5 yL，酶溶液 1. 0 yL，40pmol/ yL引物FIP1. 0 yL，40pmol/ yL引 物81?1.0 1^，1(^111〇1/1^引物？3 0.5 1^，1(^111〇1/1^引物83 0.5 1^，核酸荧光染料 1. 0 yL，RNA模板1. 0 yL，及去离子水6. 5 yL ;
[0021] 所述的RT-LAMP扩增反应的条件为：在65°C恒温条件下，扩增反应60min后，加热 至80°C，反应5min使酶失活；
[0022] 所述的RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒在植物病毒检测领域中的应用；
[0023] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0024] (1)简便易操作：本发明的方法只需要恒温水浴锅或者稳定热源的设备就能进行 实验，且实验结果通过肉眼观察反应液的颜色就可以判断，不需要专业的仪器，非专业人员 均可操作，鉴定方法适应性强，克服了常规PCR专业性强及需要专用仪器设备等局限性，从 而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。
[0025] (2)快速高效：本发明的检测方法鉴定周期为1小时，常规的RT-PCR检测鉴定方 法需要6小时左右，而血清学检测方法需要15小时左右，这样大大提高了检测效率。
[0026] (3)特异性强：本发明是通过2对引物识别靶序列上6个特异区域，而常规PCR是 通过识别靶序列上2个特异区域，血清学检测方法则是依赖于抗体与病毒的特异性结合， 但也可能与亲缘关系近的病毒种发生血清学反应（若它们的抗原决定簇相同或相似时）， 因此大大提高了特异性，减少假阳性的概率。
[0027] (4)灵敏度高：以辣椒病样总RNA进行10倍系列稀释后用作模板，分别进行 RT-LAMP反应和普通RT-PCR反应。常规RT-PCR可以在10 2倍稀释模板中检测到，而RT-LAMP 可以在10 6倍稀释模板中检测到，表明RT-LAMP检测方法比常规RT-LAMP检测灵敏度高 10000 倍。
【附图说明】
[0028] 图1是RT-LAMP最佳反应温度扩增曲线结果分析图。
[0029] 图2是RT-LAMP各温度处理反应液颜色变化结果分析图。
[0030] 图3是RT-LAMP灵敏度实验颜色反应结果分析图。
[0031] 图4是RT-PCR灵敏度电泳结果分析图。
[0032] 图5是RT-LAMP检测田间辣椒病样检测结果分析图；其中，1~6 :疑似辣椒病样， 7:阴性对照；8:阳性对照。
[0033] 图6是RT-PCR检测田间辣椒病样的电泳结果分析图；其中，M :2000bp marker， 1~6:疑似辣椒病样，7:阴性对照；8:阳性对照。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实施例1引物的设计
[0036] 根据GenBank中已登录的辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白（CP)基因序列（GenBank序列 登录号：FJ617225)，设计外侧引物对F3和B3以及内侧引物对FIP和BIP，设计完成后将引 物在NCBI数据库中Primer-Blast模块下进行比对验证，最终选取以下RT-LAMP引物组：
[0037] F3:CTTGAATGGCTTAATGGTTTG；
[0038] B3:CGCTTCTCAATGTACGCT ；
[0039] FIP:CTCTTCACCATCAACCATCACCCTGTATAGAAAATGGGACATCGC ；
[0040] BIP:ATCCAATTAAGCCATTGATTGACCATACTGAAATGCGCCATGA。
[0041] 实施例2RT-LAMP体系的建立及优化
[0042] (-）实验材料
[0043] 应用已知辣椒脉斑驳病毒侵染引起的辣椒病叶组织以及已知健康的辣椒叶组织 为材料。
[0044] 辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含如下组分：实施例1设计合成的 RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料；
[0045] RT-LAMP反应液（2X反应缓冲液，荣研生物科技（中国）有限公司）包含如下组 * :Tris-HCl(pH8.8)40mM;KC120mM;MgS0416mM ;(NH4)2S0420mM;Tween20 0.2 %(w/w); Betaine 1. 6M ;dNTPs 每种 2. 8mM;
[0046] 酶溶液（荣研生物科技（中国）有限公司）为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的 混合溶液；
[0047] 核酸荧光染料（荣研生物科技（中国）有限公司）为荧光目视检测试剂；
[0048] (二）实验方法
[0049] (1)检测病样总RNA提取：称取0. lg待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研成极 细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加1 mL Trizol后于室温下静置lOmin， 使其充分裂解；12 000r/min，4°C离心5min，弃沉淀，加200 yL氯仿，振荡混匀后于室温放 置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0. 5mL异丙醇， 混勾后于室温放置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加1 mL体 积分数为75%的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4°C离心5min，弃上清， 室温晾干或真空干燥5~lOmin，最后用40 y L RNase-free ddH20溶解RNA样品，于-80°C 保存，即为待检模板RNA。
[0050] (2)RT-LAMP反应体系（25 y L) :2X反应缓冲液（荣研生物科技（中国）有限 公司）12.5yL，酶溶液（荣研生物科技（中国）有限公司）1.〇1^，4(^111 〇1/1^引物？1? 1. 0 y L，40pmol/ y L 弓| 物 BIP 1. 0 y L，lOpmol/ y L 弓| 物 F3 0? 5 y L，lOpmol/ y L 引物 B3 〇? 5 y L，荧光目视检测试剂（荣研生物科技（中国）有限公司）1. 0 y L，RNA模板1. 0 y L， 及去尚子水6. 5 y L。
[0051] RT-LAMP扩增反应的条件为：反应温度分别设为61°C、63°C或65°C，反应时间为 60min。扩增反应在实时池度仪上进行，根据60min内出现扩增曲线的时间和池度确定最佳 反应温度，并肉眼观察反应液颜色变化情况。
[0052] (3)结果鉴别：扩增进行时，如果有产物出现，反应液会产生一定的浊度；LA-320C 实时浊度仪（荣研生物科技（中国）有限公司）会将浊度信号收集，以扩增曲线的形式反 映。反应结束后，肉眼观察各处理反应液的颜色变化，并与浊度仪曲线进行比对。若反应液 呈绿色，则判定为阳性反应：若呈橙色，则判定为阴性反应。
[0053](三）实验结果与分析
[0054] 以感染辣椒脉斑驳病毒辣椒病叶组织的总RNA为模板，进行RT-LAMP反应，实时 浊度仪输出的扩增时间曲线结果如图1。由图中曲线可以看出，RT-LAMP反应61°C、63°C和 65°C的反应温