与A β 42共培养 24h后培养物的ThT荧光强度变化
[0048] 首先将Αβ 42溶于六氟异丙醇溶液，得到lmg/mL的Αβ 42溶液，超声IOminJiAP 处于单分散状态，冷冻干燥，获得A β 42干粉，于-20°C保存。
[0049] 称取 3. 99mg 的 ThT 溶于 500mL 的磷酸盐缓冲液（PBS，phosphate buffer saline) 溶液（其中磷酸盐浓度为100mm〇l/L，NaCl浓度为lOmmol/L)，得到终浓度为25 μ mol/L的 ThT溶液。
[0050] 称取5mg的A β 42,溶于4. 03mL的NaOH溶液（浓度为20mmol/L)中，超声IOmin 使之充分溶解，4°C，16000g离心20min，取总体积75 %的上清液，得到A β 42溶液（浓度 为275 μ mol/L)。用ThT溶液稀释，得到终浓度为25 μ mol/L的A β 42溶液。将其按每孔 200 μ L滴加在96孔板中，置于37 °C条件下进行培养。
[0051 ] 将多肽功能化的金纳米粒子水溶液使用ThT溶液稀释，获得浓度为3. 85nmol/L的 多肽功能化的金纳米粒子溶液，并按梯度稀释获得浓度分别为2. 2、I. 1、0. 55和0.1 lnmol/ L的多肽功能化的金纳米粒子溶液。取浓度为275 μ mol/L的A β 42溶液，分别用不同浓度 的多肽功能化的金纳米粒子溶液稀释，获得含3. 5、2、1、0. 5和0. lnmol/L多肽功能化的金 纳米粒子的A β 42溶液（A β 42的终浓度为25 μ mol/L)。将五种溶液按每孔200 μ L分别滴 加在96孔板中，置于37°C条件下进行培养。
[0052] 将96孔板置于酶标仪中，在37°C下恒温培养。每IOmin振动孔板10s。培养时间 到达24h后，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，激发光带宽为9nm，发射 光带宽为20nm。测定结果取三个平行样品的平均值。以只含Αβ的样品为100%对照组， 将480nm处的ThT荧光强度（％)对多肽功能化的金纳米粒子的浓度作图，结果如图3所 不。
[0053] 由图3可知，加入多肽功能化的金纳米粒子后A β 42的ThT荧光强度明显下降，说 明多肽功能化的金纳米粒子有效增强了抑制Aβ 42聚集的效果。ThT荧光强度下降程度与 多肽功能化的金纳米粒子的浓度呈正比，说明多肽功能化的金纳米粒子浓度越高，其抑制 A β 42聚集效果越好。
[0054] 实施例4 : lnmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养24h后培养物 的聚集体形态变化
[0055] 按照与实施例3相同的方法处理Αβ 42,并配制含lnmol/L多肽功能化的金纳米粒 子的A β 42溶液，溶液中A β 42的终浓度为25 μ mol/L。将上述溶液于37°C，150rpm条件下 进行培养。
[0056] 培养时间到达24h后，取100 μ L的A β 42培养液，超声10min，将5-10 μ L溶液滴 加在300目的碳膜铜网上，自然干燥。待铜网上的溶液将干未干时，滴加1 %的磷钨酸溶液 (pH = 6. 5)染色30s后吸掉多余液体，自然干燥。然后用透射电镜（JEM100CXII)进行观 察，检测电压为100kV，选取放大后标尺为IOOnm的图像进行观察，结果如图4所示。
[0057] 由图4A可知，Αβ 42在单独培养24h后形成了 10-20nm宽，数百纳米长的带状状 维；由图4B可知，加入lnmol/L的多肽功能化的金纳米粒子后，A β 42纤维的形态发生了变 化。加入多肽功能化的金纳米粒子的样品中Αβ 42纤维的数量显著减少了，纤维长度缩短 呈不规则的长棒状分散聚集体。这说明，多肽功能化的金纳米粒子改变了 Aβ 42聚集体的 形貌，抑制了 Aβ 42纤维的生成。
[0058] 实施例5 : lnmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养24h后培养物 的粒径分布
[0059] 按照与实施例3相同的方法处理A β 42,并配制含lnmol/L的多肽功能化的金纳米 粒子的A β 42培养液，其中A β 42终浓度为25 μ mol/L。将上述溶液置于37°C，150rpm条件 下进行培养。在培养24h后，取培养液使用去离子水稀释至A β终浓度为10 μ g/mL，通过粒 径分析仪（Malvern Instruments)，在25°C下对样品进行分析，结果如图5所示。
[0060] 从图5中可以看出，作为对照的Αβ42单独培养出现了粒径为200-1000nm左右 的聚集体。而多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养的样品中，可以同时观察到粒径为 20-40nm表征多肽功能化的金纳米粒子的峰和粒径为200-1000nm左右表征Αβ 42聚集体的 峰。多肽功能化的金纳米粒子减少了 Aβ 42聚集体生成的数量，聚集体的平均粒径明显降 低。上述结果说明，多肽功能化的金纳米粒子抑制了 Αβ42聚集体的生成，改变了 Αβ的聚 集路径。
[0061] 实施例6 :0. lnmol/L-3. 5nmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养 24h后培养物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性
[0062] 细胞毒性实验中使用的细胞为人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y)。培养基为 DMEM/F-12培养基，含20 % FBS，2mmo 1/L谷氨酰胺，100U/mL双抗。培养环境为5 % C02，37 °C 恒温培养。
[0063] 按照与实施例3相同的方法处理Αβ 42,并配制含不同浓度（35、10、5和lnmol/L) 的多肽功能化的金纳米粒子的A β 42溶液，溶液中A β 42的终浓度为250 μ mol/L。
[0064] 在MTT实验中，将细胞按每孔90 μ L培养液，5000个细胞的密度加入96孔板 中。培养24h后，加入老化后的Αβ 42或Αβ 42与多肽功能化的金纳米粒子共培养的样品 (10 μ L)，最终使加药孔每孔中GNP或多肽功能化的金纳米粒子的终浓度为3. 5、1、0. 5和 0. lnmol/L，A β 42的终浓度为25 μ mol/L。继续培养48h后移除培养基，将细胞使用pH = 7. 4的PBS溶液清洗并更换为无血清培养基。然后在每孔中加入10 μ L MTT溶液（浓度为 6mg/mL)，继续培养4h。检测时，将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔 板中溶液，每孔加入100 μ L的DMSO摇床震荡10min。待紫色晶体完全溶解后，使用酶标仪 在570nm下测定吸光度，计算细胞存活率。以不含细胞的样品作为空白组（0%);不含Αβ 和抑制剂，仅含有细胞的样品作为对照组（100% )，计算加药组的细胞存活率。实验中每个 纳米粒子浓度梯度设置6个复孔。结果如图6Α所示。
[0065] 在LDH释放实验中，将细胞按每孔90 μ L培养液，5000个细胞的密度加入96孔板 中。培养24h后，将培养基更换为无血清培养基，并加入老化后的A β 42或A β 42与多肽功 能化的金纳米粒子共培养的样品（10 μ L)，最终使加药孔每孔中GNP或多肽功能化的金纳 米粒子的终浓度为3. 5、1、0. 5和0. lnmol/L，Αβ 42的终浓度为25 ymol/L。继续培养48h 后，进行LDH释放检测。检测前，在阳性对照孔中加入1 % (V/V)的Triton X-100培养lh， 将细胞完全裂解，作为LDH释放最大值的阳性对照组（细胞死亡率100% )。细胞外LDH 释放通过试剂盒进行测定。简而言之，将96孔板在400g下离心5min，收集每孔的上清液 (80 μ L)加入40 μ L LDH反应液，混匀后在室温下反应30min后进行测定。测定时使用酶 标仪，在实验波长490nm，参考波长630nm下进行吸光值检测。检测时将GNP造成的吸收值 作为背景除去。以只含有细胞的样品作为空白组，加入triton X-100完全裂解的细胞样品 作为阳性对照组（100%)，计算加药组的LDH释放率。实验中每个纳米粒子浓度梯度设置 6个复孔。结果如图6B所示。
[0066] 由图6A可知，Αβ 42单独存在时，细胞存活率为48. 46%。而加入不同浓度的多 肽功能化的金纳米粒子（l、〇. 5和0. lnmol/L)后SH-SY5Y细胞存活率提高到60. 31 %、 72. 09 %、82. 18 %，说明多肽功能化的金纳米粒子能够有效抑制A β 42寡聚体产生的细胞 毒性。由图6Β可知，A β 42单独存在时，细胞LDH释放率为31. 67%。而加入不同浓度的多 肽功能化的金纳米粒子（1、〇. 5和0. lnmol/L)后SH-SY5Y细胞LDH释放率降低到21. 54%、 14. 52 %、12. 38%，说明多肽功能化的金纳米粒子能够有效抑制A β 42寡聚体造成的细胞 凋亡。
[0067] 本发明提出了在金纳米粒子的基础上，通过化学修饰的方法，使其表面带有可用 于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽配基（VVIACLPFFD)，制备得到多肽功能化的金纳米粒子。 提出了多肽功能化的金纳米粒子在制备抑制淀粉样蛋白聚集的药物等方面的用途，并 将其应用于Αβ 42的构象变化、聚集和细胞毒性抑制实验。已通过现场较佳实施例子进行 了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法进行 改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽，其特征是具有SEQ ID No. 1氨基酸序列： Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp〇2. 利用抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽得到的多肽功能化的金纳米粒子，其特征是结 构表达如下：3. 权利要求2的多肽功能化的金纳米粒子的制备方法，其特征是从A β的经典抑制剂 LPFFD和C末端序列VVIA出发，设计得到多肽VVIACLPFFD，并在金纳米粒子表面形成特定 的结构。4. 如权利要求2多肽功能化的金纳米粒子作为制备治疗阿尔茨海默氏症的药物的应 用。
【专利摘要】本发明涉及一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽和多肽功能化的金纳米粒子及制备和应用。首先从Aβ的经典抑制剂LPFFD和C末端序列VVIA出发，经过理性设计得到特定多肽VVIACLPFFD，这一多肽分子能够同时发挥LPFFD和VVIA的抑制性质，不会彼此冲突，能够在金纳米粒子表面形成特定的结构，放大其抑制聚集的效果。将其修饰在金纳米粒子上，通过多肽自身的抑制作用和与纳米粒子的协同作用，提高其与Aβ间的相互作用，有效抑制Aβ聚集。氨基酸序列为：Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp。作为制备治疗阿尔茨海默氏症的药物的应用有广阔的前景。
【IPC分类】C07K7/06, A61K47/48, B22F1/00, A61P25/28, A61K9/14, B22F9/24, A61K38/08
【公开号】CN105061561
【申请号】CN201510431675
【发明人】董晓燕, 熊能, 余林玲, 史清洪, 孙彦
【申请人】天津大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月21日