一种用dna条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于真菌物种鉴定领域，具体而言，本发明涉及一种用DNA条形码鉴别捕 食线虫丝孢菌节丛孢属的方法。
【背景技术】：
[0002] 植物寄生线虫病是一类在世界范围内普遍发生的植物病害，目前已知的根结线虫 种类就有70多种，危害3000多种植物，全球每年因线虫病造成的损失高达1580多亿美元。 在我国，线虫危害蔬菜、烟草、花卉、林木、中药材、棉花、大豆等几乎所有的作物，松材线虫 被称为无烟森林火灾，在国内多个省区广泛发生，成为农林业生产的重要限制因子之一。面 临如此严重的线虫侵害现象，目前已开发多种杀线虫试剂，但长期使用化学农药除了造成 环境污染、残留、破坏生态平衡等弊端外，更加剧了线虫的抗药性，开发对环境安全的生物 农药已经越来越受到关注。捕食线虫丝孢菌作为病原线虫的重要天敌，是自然界中控制、平 衡和调节线虫种群数量的重要生物因子，也是研究开发生物杀线虫剂的宝贵资源，保护和 评估具有潜在经济价值的捕食线虫丝孢菌具有重要的科学和应用价值。目前国内外开发的 线虫生防制剂已达6个，其中有两个Royal300和Royal350均是利用节丛孢属真菌开发的 生防产品，节丛孢属真菌资源在线虫生防产品开发中具有举足轻重的地位。
[0003] 目前全世界共报道捕食线虫丝孢菌96种，包含节丛孢属Arthrobotrys、亚隔指孢 属Dactylellina和德氏霉属Drechslerella等重要属，其中节丛孢属54种。尽管目前已经 有比较清晰的属级水平上的分类概念，但由于不同的研究者对种的概念有不同的理解，故 捕食线虫丝孢菌在物种水平上的争议依然存在。物种的划分还是依赖于传统的形态结构， 即分生孢子和分生孢子梗的形态，导致捕食线虫丝孢菌种间、种内分类同名异物、同物异名 的问题普遍存在，至今还没有形成一个公认的分类系统和种间清晰的分类界限，严重阻碍 了该类重要菌种资源的挖掘和开发。
[0004] 由于依靠形态学结构的传统分类在真菌分类中有很大的局限性，近年来分子数据 受到了真菌分类学家们的青睐，基于DNA序列并加以形态结构特征辅佐的物种鉴定方法将 快速取代早期仅依靠形态结构特征的物种鉴定方式。DNA条形码是一种基于DNA序列进行 生物物种鉴定的技术，即利用标准化的一个或几个DNA片段进行序列分析，根据核苷酸序 列差异，实现快速和准确地鉴定物种。通常，DNA条形码筛选有以下标准：（1)标准的短片 段；（2)要有足够的变异能将物种分开来，种间差异比较大，便于进行种与种的区分，种内 序列变异尽量小，从而使种间和种内变异有一个明晰的界定；（3)序列两段相对保守，以方 便引物的设计。目前，还未报道有某条特定DNA条形码能够适用于所有真菌的鉴别，因此针 对具体的真菌类群，仍需要进行实验来寻找到合适的基因序列作为DNA条形码使用。利用 DNA条形码技术来对捕食线虫丝孢菌物种进行便捷准确地鉴定，对于扩大该类重要真菌种 质资源，挖掘生物防治应用菌株，揭示重要捕食线虫丝孢菌的物种多样性和遗传多样性都 具有十分重要的意义。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供一种准确、快捷的用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛 孢属的方法。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法，包括RPB2基因序列片段 的基因库的建立和新样品的鉴别步骤；其中：
[0008] (1)RPB2基因序列片段的基因库的建立：收集《中国真菌志》第三十三卷《节丛孢 及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种为材料，然后提取其基因组DNA，以其为模板，优 选SEQIDN0. 55和SEQIDN0. 56引物序列扩增样品的RPB2基因序列片段，由此建立包括 捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库；所述基因库包括下述序列编号所示的RPB2基因 序列片段：SEQIDN0. 1-54 ;
[0009] (2)新样品的鉴别：通过将待鉴别真菌的序列与基因库内已有的序列之间的进行 比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的系统发生树法设立 鉴定规则来鉴别物种，获得多个序列间的相似性，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最 小的对应物种即为待鉴别真菌的物种；具体如下：
[0010] a?基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法设立鉴定规则来鉴别物种
[0011] 将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对，使用Mega6. 0软件计算未鉴 定样品DNA条形码序列与数据库中每一个序列的Kimura-2-parameter遗传距离，计算种内 种间变异值，鉴别物种；对于基因库内的捕食线虫丝孢菌序列，已经计算出捕食线虫丝孢菌 节丛孢属的种内最大变异值，当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后，得到 多个序列间最小变异值即种间最小变异值，这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最 大变异值，视为与其同一物种；
[0012] b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种
[0013] 应用MEGA或PAUP软件构建NJ、ML、MP系统发育树，检验未鉴定样品的DNA条形码 序列与数据库中序列聚类在一起的物种，若未知样品与数据库中的物种构成单支系，则鉴 定为该物种。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] 1、优选RPB2基因作为最适合鉴别捕食线虫丝孢菌的DNA条形码，相比于其他基 因，RPB2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。
[0016] 2、建立了包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库和新样品的鉴别方法，相 比于传统的形态显微观察进行鉴定的方法，鉴定效率大大提高，对于样品的完整程度要求 低，鉴别指标能够量化，加之同时使用Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类 分析的系统发生树法设立鉴定规则进行鉴定，其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的 DNA条形码方法，弥补了捕食线虫丝孢菌DNA条形码分子标记的空白，为捕食线虫丝孢菌的 种质资源挖掘、生防应用和遗传多样性研究提供有力的研究工具。
【附图说明】：
[0017] 图1是基于RPB2基因库中菌株和待鉴定菌株SP1的遗传距离构建的NJ树。
【具体实施方式】：
[0018] 实施例1 :捕食线虫丝孢菌节丛孢属DNA条形码即RPB2基因序列片段的基因库的 建立
[0019] (1)所选菌株捕食线虫丝孢菌节丛孢属共计有32个种，54个菌株，均是《中国真菌 志》第三十三卷《节丛孢及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种，且每个常见种至少包 含3个菌株，以满足后续计算种内最大遗传变异值的需要。详细信息见表1。
[0020] 表1样品信息表
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[0024] (2)将表1中所列样品纯培养菌株接种于CMA平板[玉米粉培养基：玉米粉30g， 琼脂16g，水1000ml，自然pH，玉米粉加水适量煮沸30分钟，四层纱布过滤，滤液加水至 1000ml，混匀，分装。121°C灭菌20-30分钟]和PDA平板[土豆培养基：去皮土豆200g，葡 萄糖20g，琼脂16g，水1000ml，自然pH，将土豆削皮后，切成小块，加水适量煮沸30分钟，四 层纱布过滤，滤液加水至l000ml，混匀，分装。121°C灭菌20-30分钟]。CMA平板转接的菌 株待菌丝长满后保藏于4°C，以便后续使用。而PDA平板则用于富集营养菌丝，用于提取总 DNA用。
[0025] (3)基因组DNA采用改进过的CTAB法提取：往步骤⑵中收集好菌丝的离心管 中加入0? 3g的石英砂（Sigma)，再加入850yL的CTAB裂解液[2 %CTAB(w/v) ;lOOmM Tris-HC1;1.4MNaCl;20mMEDTA，pH8. 0]，用研