促进双阴性t细胞体外增殖的四环化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域的一种促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物，尤其 设及一种促进CD37CD4/CD8双阴性T值NT)细胞体外增殖的四环化合物。
【背景技术】
[0002] 免疫疗法被认为是癌症治疗的第S次革命，其中嵌合抗原受体T细胞（CAR-T)技 术对CD19+急性B淋己细胞白血病的卓越的临床试验结果已经引起医学界的广泛关注，被 认为是最有希望治愈肿瘤的疗法。
[0003] 然而，当前的CAR-T治疗是用患者自体T细胞进行CAR-T细胞改造，运就对患者的 T细胞数量，活力与增殖能力有很高的要求。临床试验实践中发现，超过80%的患者的T细 胞达不到CAR-T细胞制备的要求，因此大多数患者无法从现行的CAR-T治疗中受益。鉴于 运一问题，同源异体类CAR-T的制备成为研究的热点。
[0004] 目前的研究策略是通过基因敲除技术将同源异体来源的T细胞的T细胞受体 (TCR)敲除后，使其失去MHC限制的特性，然后纯化出TCR敲除的T细胞，再进行CAR-T细胞 的制备，使之发挥肿瘤杀伤作用且避免引起移植物抗宿主疾病（GVHD)。但在实际操作中遇 到很大的技术瓶颈，主要原因是用于基因敲除技术的CRISPR-化s9等载体分子量较大，导 入T细胞困难、基因敲除的效率低下。并且，如果使用病毒转染的方式导入CRISPR-化s9等 载体，又会出现嵌合抗原受体二次病毒转染的抵制现象，CAR-T细胞得率低下，不能进行大 规模制备，应用性差。
[0005] 已有的研究发现，正常人的外周血中存在一群CD37CD4 /CD8双阴性T值NT)细 胞，其不具有血1C限制性，不会引起移植物抗宿主疾病，结合已有的嵌合抗原受体技术，构 建出一种新型的嵌合抗原受体DN-T细胞（CAR-DN-T)，可W异体回输肿瘤患者。但是，鉴于 DNT细胞仅占约占外周血单个核细胞（PBMC)的1-5%，难W达到CAR-DN-T治疗所需的细胞 量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术存在的W上问题，提供一种促进双阴性T细胞体 外增殖的四环化合物。
[0007] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过W下技术方案实现： 一种促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物，所述四环化合物为IMC-00239,其分子 式为：
[000引进一步的，所述促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物促进DNT细胞体外增殖 的应用。
[0009] 本发明的有益效果是： 1、发明设及用高通量筛选法从化合物库中筛选到能促进CD37CD4 /CD8双阴性T值N T)细胞体外增殖的四环化合物，包括其药学上可接受的盐和前药。该类化合物是Wnt信号 通路的抑制剂，在体外实验中能诱导DNT细胞P-Catenin的降解，促进细胞周期与有丝 分裂。由于DNT细胞不具有M肥限制性，不会引起移植物抗宿主疾病（GVHD)，结合已有的 嵌合抗原受体（CAR)技术，构建出一种新型的嵌合抗原受体DN-T细胞（CAR-DN-T)，可W异 体回输肿瘤患者，实现CAR-T细胞工厂的产业化。鉴于DNT细胞仅占约占外周血单个核细 胞（PBMC)的1-5%，需建立高效的体外大规模扩增系统才能满足CAR-DN-T治疗的细胞量需 求。此类化合物可W有效的促进CAR-DN-T体外扩增系统的构建，帮助CAR-DN-T细胞工厂 的实现。
[0010] 2、通过基于原代DNT细胞的高通量细胞增殖筛选平台所获得的化合物 IMC-00239与T细胞受体抗体和细胞因子联用，能做体外高效促进DNT细胞增殖，其扩增能 力超过4000倍，比T细胞受体抗体和细胞因子处理组高出7倍，且呈剂量依赖效应。该化 合物在兰30iiM下无明显细胞毒性。进一步研究发现IMC-00239主要通过抑制Wnt信号通 路诱导P-Catenin降解调控DNT细胞的增殖。IMC-00239对DNT细胞的促增殖作用有力 的支持的CAR-DN-T细胞体外扩增系统的建立，满足了治疗所需细胞量。
[0011] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 本发明的【具体实施方式】由W下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0012] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1为基于原代DNT细胞的高通量细胞增殖筛选W及CAR-T杀伤实验流程图； 图2为IMC-00239促进DNT细胞的增殖及其信号通路图一； 图3为IMC-00239促进DNT细胞的增殖及其信号通路图二； 图4为IMC-00239促进DNT细胞的增殖及其信号通路图S; 图5为IMC-00239促进DNT细胞的增殖及其信号通路图四； 图6为IMC-00239对CAR-DN-T增殖的促进作用示意图； 图7为IMC-00239化合物处理的CAR-DN-T细胞具有体外杀伤功能示意图。
【具体实施方式】
[0013] 下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0014] 鉴于DNT细胞仅占外周血单个核细胞（PBMC)的1-5%，需建立高效的体外大规模 扩增系统才能满足CAR-DN-T治疗的细胞量需求。我们建立基于原代DNT细胞的高通量 细胞增殖筛选平台，并将筛选到的化合物在CAR-DN-T细胞上进一步验证，并确证其不影响 CAR-T的细胞杀伤能力，具体流程见图1所示。通过运一平台，我们发现一系列能够促进DN T细胞增殖的小分子化合物，其中，作用最强的是一个四环化合物（IMC-00239)，其分子式 为：
[0015] 我们通过基于原代DNT细胞的高通量细胞增殖筛选平台所获得的化合物 IMC-00239与T细胞受体抗体和细胞因子联用，能做体外高效促进DNT细胞增殖，其扩增能 力超过4000倍，比T细胞受体抗体和细胞因子处理组高出7倍（0. 5yM，参照图2所示)，且 呈剂量依赖效应（pEC50=7.2,参照图3所示)。该化合物在^ 30iiM下无明显细胞毒性，参 照图4所示。进一步研究发现IMC-00239主要通过抑制Wnt信号通路诱导P-Catenin降 解调控DNT细胞的增殖，参照图5所示。IMC-00239对DNT细胞的促增殖作用有力的支持 的CAR-DN-T细胞体外扩增系统的建立，满足了治疗所需细胞量。 实施例
[0016] IMC-00239对CAR-DN-T的促扩增作用，且不影响CAR-DN-T的细胞杀伤功能。
[0017] 从健康捐献者外周血单个核细胞中分选出的DNT细胞经嵌合抗原受体的慢病毒 感染后，分别用T细胞受体抗体和细胞因子（Vehicle)W及0. 5yMIMC-00239联合T细 胞受体抗体和细胞因子刺激，培养14天。IMC-00239组细胞数高于Vehicle组约7倍左 右，参照图6所示。将IMC-00239组与细胞因子组CAR-DN-T进行细胞杀伤能力的比较发现 IMC-00239对CAR-DN-T的细胞杀伤能力无明显影响，参照图7所示。
[0018] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物，其特征在于，所述四环化合物为 IMC-00239,其分子式为：2. 根据权利要求1所述的促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物促进DNT细胞体 外增殖的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种促进双阴性T细胞体外增殖的四环化合物，所述四环化合物为IMC-00239，其分子式为：。本发明涉及用高通量筛选法从化合物库中筛选到能促进CD3+/CD4-/CD8-双阴性T(DN？T)细胞体外增殖的四环化合物，包括其药学上可接受的盐和前药。该类化合物是Wnt信号通路的抑制剂，在体外实验中能诱导DN？T细胞β-Catenin的降解,促进细胞周期与有丝分裂。此类化合物可以有效的促进CAR-DN-T体外扩增系统的构建，帮助CAR-DN-T细胞工厂的实现。
【IPC分类】A61P35/00, C07D209/52
【公开号】CN105198790
【申请号】CN201510186837
【发明人】范国煌, 廖诗骅, 陈曦, 李润生
【申请人】范国煌
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年4月20日