一种名为茶山奈苷b的黄酮氧苷类化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学技术领域，具体涉及一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 山茶属植物茶（Camelliasinensis)及其叶部加工产品如绿茶、红茶、黑茶等中均 含有具有良好生物活性的黄酮和黄酮苷类化合物，它们是自然界中很重要的一类天然有机 化合物。早在1991年Finger等就从茶鲜叶、红茶、绿茶中分别鉴定出20种黄酮醇及其糖 苷，邹艳丽等也从普洱熟茶中分离得到三个黄酮类化合物。因此，说明茶产品中含有很多具 有预防心血管疾病、抗菌、抗癌等功效的黄酮类活性生物成分，这些具有保健功效的天然成 分备受人们关注，这也将成为医药研究领域的研究热点。
[0003] 茯砖茶（Fuzhuanbricktea)是黑茶的一种，其制作已有一百多年的历史。该茶 是以茶树的叶为原料，经过渥堆、压制、发花后制得。其中在渥堆发酵过程中形成了茯砖茶 特有的"金花"，因此，在香气方面形成了其独特的"菌花香"。茯砖茶主要产于我国湖南和 陕西两省，现广泛销往全国各地和东南亚地区。这种茶除了作为茶饮料使用外，还可用于降 脂降压、降血糖、治疗菌痢等用途（见下方文献）。
[0004] [1]邢志华，佟启鹏，赵宇，闫锦.绿茶类黄酮生物活性研究进展.药学与临床， 2013,4(7).
[0005] [2]侯冬岩，回瑞华，杨梅.绿茶及其饮料中总黄酮的分析.分析实验室，2003， 22(6) :86-88.
[0006] [3]邹艳丽，董宝生，张伏全.普洱熟茶化学成分研究.云南化工.2009， (2) :10-13.
[0007] [4]傅东和，刘仲华，黄建安，龚雨顺，陈金华.高通量筛选研究茯砖茶降脂功 效·茶叶科学，2006, 26 (3) :209-214.
[0008] [5]侯凯东·茯砖茶市场与收藏前景广阔诱人·茶叶经济信息，2006，（7) : 12-15.
[0009] 茯砖茶因其加工过程中有微生物参与而发生了复杂变化，这些变化也许会产生某 些具有特殊药理作用的新化合物。目前对于茯砖茶生物活性的化学基础的报道还比较少， 若能成功的从茯砖茶这一黑茶资源中研究开发出具有生物活性的黄酮糖苷类化合物成分， 将对农业和医药等领域作出重要贡献。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一是提供了一种名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物，此名为茶 山奈苷B(camellikaempferoside B)的黄酮氧苷类化合物具有如下结构：
[0011]
[0012] 本发明的目的之二是提供一种上述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物的制备 方法，其包括以下步骤：
[0013] 1)、取茯砖茶，并将茯砖茶粉碎；
[0014] 2)、将粉碎后的茯砖茶用70wt%的丙酮溶液浸泡72小时，或者将粉碎后的茯砖茶 用70wt%的丙酮溶液浸泡后超声波振荡提取，并将提取液经过减压浓缩制得膏状提取物；
[0015] 3)、将所述膏状提取物悬浮于水中得到水混悬液，再用石油醚、氯仿、正丁醇依次 萃取，将最终得到的正丁醇萃取液减压浓缩至膏状；
[0016] 4)、将所述膏状体用热水溶解得到溶解液，接着利用羟丙基凝胶柱层析即 SephadexLH-20凝胶柱层析；将溶解液使用甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱， 收集其中甲醇-水体积比20:80到40:60间的洗脱组分；将得到的洗脱组分使用MCI柱层 析纯化，以甲醇-水体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，分别收集相应体积比间的洗脱 组分，将其中甲醇-水体积比70:30洗脱得到的组分再经过聚酰胺柱层析以丙酮-水体积 比1:2洗脱，每20mL收集一个馏分，将其中的第9~17组馏分合并、蒸干，最后经过0DS反 相硅胶柱层析即十八烷基键合硅胶柱层析，以甲醇-水体积比5:4洗脱，每20mL收集一个 馏分，取其中第20~25馏分合并、蒸干，可得到茶山奈苷B。
[0017] 本发明的目的之三是提供一种上述名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物在制备 抗阿尔茨海默病药物方面的应用。
[0018]通过试验证实，本发明提供的名为茶山奈苷B的黄酮氧苷类化合物抑制β-淀粉 样蛋白（Αβ)的产生和Αβ的聚集，从而进一步抑制Αβ引起的一系列细胞生物学反应，可 以应用于制备抗阿茨海默病药物方面。
[0019] 具体的，本发明中的所述名为茶山奈苷Β的黄酮氧苷类化合物可以和药学上所通 用的辅料制成口服、外用、注射等剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等口服药剂；栓 剂、徐剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等外用药剂；注射液、混悬液、冻干粉末等注射药剂，参照制 药领域的常规方法制备。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 1)、本发明成功的从茯砖茶这一黑茶资源中研究开发出具有生物活性的黄酮糖苷 类化合物成分，对农业和医药等领域具有重大的意义。
[0022] 2)、本发明从茯砖茶中制备得到一个具有生物活性的黄酮氧苷类化合物茶山奈苷 Β，为有效开发利用茯砖茶提供了广阔的前景。
[0023] 3)、本发明制备方法简单，采用常规的有机提纯步骤即可，有利于降低制备成本。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明茶山奈苷B(camellikaempferoside B)的化学结构式。
[0025] 图2A、2B为本发明茶山奈苷B抑制Αβ产生的试验图。
[0026] 图3Α~3C为茶山奈苷Β抑制Αβ聚集成纤维的对照试验图。
[0027] 图4Α~4D为茶山奈苷Β促进异常Αβ寡聚体形成的对比试验图。
[0028] 图5Α~5C为茶山奈苷Β抑制Αβ引起的ΗΤ22海马神经元细胞死亡的对比试验 图。
[0029] 图6Α、6Β为茶山奈苷Β抑制Αβ弓丨起原代小胶质细胞激活及炎症介质产生的对照 试验图。
[0030] 图7为茶山奈苷Β抑制Αβ弓丨起小胶质细胞氧化应激的对照试验图。
[0031] 注：附图中的YCF-2为茶山奈苷Β。
【具体实施方式】
[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描 述。
[0033] 本发明中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0034]本发明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0035] 一、茶山奈昔B(camellikaempferosideΒ)
[0036]
[0037]二、茶山奈苷B(camellikaempferosideB)的制备
[0038] (1)取3. 6公斤茯砖茶，并将茯砖茶粉碎；
[0039] (2)每次用6升70wt%的丙酮水溶液浸提粉碎后的茯砖茶，每次浸泡72小时，共 浸提3次。将所得丙酮水提取液浓缩至膏状，得浸膏800克；
[0040] (3)将上述所得浸膏悬浮于2L水中得到水混悬液，该水混悬液先用2L的石油醚依 次萃取3次后得到的第一次剩余水混悬液即为萃取过石油醚的水混悬液，经减压浓缩得到 石油醚部分浸膏50克；
[0041] 将萃取过石油醚的水混悬液再用2L的氯仿依次萃取3次后得到的第二次剩余水 混悬液即为萃取过氯仿的水混悬液，经减压浓缩得到氯仿部分浸膏460克；
[0042] 将萃取过氯仿的水混悬液再用2L的正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液待用；
[0043] 将所述正丁醇萃取液减压浓缩至膏状500克，然后用500mL热水溶解，再通过 SephadexLH-20凝胶柱层析，使用甲醇水体积比0:100到100:0梯度洗脱，收集其中甲醇 水体积比20:80到40:60间的洗脱组分，然后使用MCI柱层析分离纯化，以甲醇-水体积比 0:100到100:0作为梯度洗脱，分别收集相应体积比间的洗脱组分，将其中甲醇-水体积比 70:30洗脱得到的组分经过聚酰胺柱层析以丙酮-水体积比1:2洗脱，每20mL收集一个馏 分，将编号9-17馏分合并、蒸干，然后再经0DS反相硅胶柱层析即十八烷基键合硅胶柱层 析，以甲醇-水体积比5:4洗脱，每20mL收集一个馏分，取其中第20~25馏分合并、蒸干， 可得到茶山奈苷B(8.6毫克）。
[0044] 产物茶山奈苷B的特性如下：
[0045]1)、可溶于甲醇和DMS0,黄色松散粉末，
[0046] 2),υνχ^Γηη[1 (loge) :211(2.65),268(2.40),314(2.53)；
[0047] 3)、IR(KBr)VmJcm1) :3380,2918, 2850,1697, 1649,1604, 1506,1358, 1246， 1174,1133,1062,981，834,670,599,577,482,439 ;
[0048] 4)、HRESI-MS:m/z885. 2424([M-H]，C42H45021 的理论计算值为 885. 2459);核磁 共振光谱数据见表1。
[0049] 表1:茶山奈苷B的核磁共振光谱数据（?NMR在400MHz，13CNMR在100MHz条件 下测试，S单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代DMS0)。
[0050]
[0051]
[0052] a，b，c，d信号重叠
[0053] 所有波谱数据均通过i^HCOSY，HSQC和HMBC等二维核磁共振谱归属，证明了所得 化合物的结构。
[0054] 三、茶山奈苷B(camellikaempferoside B)抗阿茨海默病体外活性试验
[0055] 根据阿茨海默病的发病原理，治疗该病的方法应该是减少Αβ的产生、抑制Αβ的 聚集和加快Αβ的清除等。本发明从茯砖茶中分离纯化，并鉴定出一个全新结构的黄酮氧 苷类化合物茶山奈苷Β，可同时抑制Αβ产生和Αβ聚集。
[0056] 茶山奈苷Β按上述制备方法分离纯化获得。具体实验中的茶山奈苷Β纯度为大于 或等于95% ;茶山奈苷Β用水或DMS0溶解后于-20°C保存。
[0057] 本发明所有的试验数据都是通过至少3次独立试验获得，以平均数加减标准差 作为实验数据。数据的统计分析应用One-Way AN0VA软件进行，多组比较分析用Duncan's test〇
[0058] 1、茶山奈苷B体外抑制Αβ40和Αβ42产生
[0059] 应用Αβ40和Αβ42试剂盒（Invotrigen，USA)，测定不同浓度茶山奈苷Β对稳定 转染APP基因的人胚肾细胞（7PA2,由美国哈佛大学医学院馈赠）分泌Αβ40和Αβ42的蛋 白水平影响。
[0060] 1) 7ΡΑ2细胞培养至细胞密度约90%时，用无血清DME培养基稀释茶山奈苷Β至不 同浓度（0, 5,10和20μΜ)，添加至细胞中，继续培养24小时。
[0061] 2)收集7ΡΑ2细胞培养上清，3000rpm离心除去细胞碎片。
[0062] 3