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[00%] 根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并根据《中国真菌志第四十Ξ 卷：拟青霉属，棒束抱属戴氏霉属》（梁宗埼主编，2013)有关粉质棒束抱感染症状、分生抱 子及菌丝的形态特征进行鉴定，确定为粉质棒束抱。
[0027] 实施例二、粉质棒束抱纯化菌株生物学特性
[0028] 2. 1材料与方法
[0029] 2. 1. 1供试菌株
[0030] 选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到PDA上， 于25°C的恒溫光照（12L:12D)培养箱中培养。
[0031] 2. 1. 2菌落生长速率和产抱量的测定
[0032] 取一皿事先培养好的粉质棒束抱，用8mm的打孔器打孔，接种于另一新鲜培养基 上，做Ξ个重复，置于25Γ的恒溫光照（12D:12L)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记 录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1% 吐溫-80和无菌水，冲洗抱子，制成抱子悬浮液，再用血球计数板测定其产抱量。
[0033] 2. 1.3抱子萌发率的测定
[0034] 将菌株培养5~7天，分别用无菌水收集分生抱子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻 片测定抱子萌发率。将抱子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加 几滴无菌水保持湿度在100%RH，培养24小时后镜检，每个处理3次重复。 阳03引2.2结果
[0036] 在PDA培养上于25Γ条件下生长良好，表1结果表明，培养前3天时菌落直径平均 生长速度为0. 44cm/d，其中在培养Id、2d、3d时菌落生长速度分别为0. 09,0. 59和0.68cm/ d,培养第6、7天时，菌落增长速度最快，分别为1. 38和1.Olcm/d。表2结果表明，该菌株 产抱快、产抱量较高，培养至第5天时产抱量可达1. 03Xl〇s抱子/菌落，第10天时产抱量 达2. 13X10%子/菌落，由此表明该菌株具有较高的产抱能力。表3结果表明，24小时 抱子的萌发率平均可W达到80%W上，表明该菌株的生长情况较好，生物学活性较好。
[0037] 表1菌落直径的生长速度
[0038]
[0044] 实施例Ξ、粉质棒束抱纯化菌株对码絹金龟的室内毒力测定 W45] 3. 1、材料与方法
[0046] 3. 1. 1供试虫源
[0047] 在室内盆栽烤烟，饲养码絹金龟，选择健康活跃、大小一致的码絹金龟Ξ龄幼虫作 为试虫，将供试码絹金龟Ξ龄幼虫接种后，放置于盛有马铃馨切片的培养皿巧=12cm)中， 在25 +rC和化：24D的光周期条件下饲养。
[0048] 3. 1.2抱子悬浮液的制备
[0049] 取长势良好的纯化粉质棒束抱用无菌水将分生抱子洗下并过滤配置成1〇8抱子/ ml分生抱子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数抱子 并记录数据，用含0. 5 %吐溫80的无菌水依次稀释为108、10\ 106、105、104五个浓度梯度的 抱子悬浮液，化含0. 5%吐溫80的无菌水为空白对照，用于致病力测定。
[0050] 3. 1. 3 浸溃法
[0051] 采用浸溃法对码絹金龟3龄幼虫进行处理。即将试虫分别浸泡在浓度为1. 0X1〇8 抱子/mL的抱子悬浮液中，轻轻摇动，30s后将试虫取出惊干，选取活力较高的试虫进行试 验。将试虫置于24孔板中，并用灭菌±将幼虫覆盖，用马铃馨馨块切成小块作为饲料，每天 更换马铃馨馨块，用小喷壶喷水对幼虫进行保湿，（25 +irC恒溫培养箱中饲养。W0. 05% 吐溫-80的无菌水处理的码絹金龟2龄幼虫为对照，每个处理设3个重复，每个重复10头 试虫，连续观察lOd。每天记录试虫的死亡数及虫体表面出现绿色绿僵菌抱子的僵虫数量， 计算平均死亡率和僵虫率。数据用DPS14.0软件进行线性回归统计分析。
[0052] 3. 2、结果
[0053] 对码絹金龟Ξ龄幼虫进行毒力测定，粉质棒束抱菌株IFMZ130719分生抱子侵染 码絹金龟幼虫的生活史过程。实验结果表明：粉质棒束抱Isariafarinose化olmskiold) 化ies菌株IFMZ130719对码絹金龟Ξ龄幼虫具有较高的毒力，接种处理后第10天时累积 校正死亡率达86. 43 %，毒力回归方程为Υ= 2. 87+0. 37Χ(r= 0. 97)，其中Υ为死亡率机率 值，X抱子浓度的对数值。LCs。（抱子/mL)为5. 71X105抱子/mL，LT5。=6. 98天。表明粉 质棒束抱Isariafarinose(Holmskiold)Rries菌株IFMZ130719具有开发为控制烟田码絹 金龟幼虫的微生物农药的良好潜力。
[0054] 该菌株是我们首次从码絹金龟幼虫上分离纯化获得的粉质棒束抱Isaria farinose(Holmskiold)化ies菌株IFMZ130719，CGMCCNo. 10138,该菌株在溫度为 25°C、相 对湿度80 %W上在PDA培养基上生长快速，产抱量大，抱子萌发率高。其抱子悬浮液对码絹 金龟致病力较好，可W广泛地用于码絹金龟的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格 便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治码絹金龟 幼虫，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为码絹金 龟绿色防控及绿色烟叶生产提供依据。
[0055] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种粉质棒束孢IFMZ130719,于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 10137。2. 权利要求1所述的粉质棒束孢IFMZ130719在码絹金龟幼虫防治方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种粉质棒束孢IFMZ130719及其应用，该粉质棒束孢IFMZ130719于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.？10137。本发明是初次从烟草码绢金龟<i>Maladera？</i>sp.幼虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对危害烟草的码绢金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于码绢金龟幼虫的防治。CGMCC No.1013720141204
【IPC分类】A01N63/04, C12R1/645, C12N1/14, A01P7/04
【公开号】CN105255740
【申请号】CN201510587431
【发明人】王新中, 徐发华, 陈斌, 韩非, 杜广祖, 肖关丽, 和淑琪, 郑亚强, 王德勋
【申请人】云南省烟草公司大理州公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月16日