一种通过过量表达hac1基因提高酒精生产效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种通过过量表达HAC1基因提高酒精生产效率的方法，尤其是一种 应用转录因子单基因缺失及过量表达的酿酒酵母提高酒精对菌体得率的方法，属于生物能 源开发技术领域。
【背景技术】
[0002] 化石能源（煤、石油、天然气等）是当前世界上最主要的能源，随着世界各国经济 社会的发展，人类对能源的需求量日益递增，但化石能源的储量是有限的；同时，化石能源 燃烧产生的溫室气体造成的全球气候变暖及所带来的问题，一直困扰着人们。因此，寻找和 发展可再生的新能源已成为全世界关注的热点。燃料酒精具有清洁、安全、环境友好、及原 料可再生等优点，被认为是石油资源的理想替代品，市场潜力巨大。目前，已在欧洲、美国及 己西等国较为广泛地使用。
[0003] 微生物发酵法生产燃料酒精是当前研究的热点，酿酒酵母是理想的酒精发酵生产 菌株，具有：在简单的培养基上能够快速地生长及生产乙醇；对非生宜环境（如高渗透压、 高溫及乙醇毒害）具有较强的适应性；遗传改造操作方便；能够利用廉价的底物，发酵成本 较低等特性。利用浓膠发酵生产乙醇的技术在过去10年获得了很大的进步，但和美国等发 达国家相比仍然存在很大的差距，存在的主要问题在于：发酵前期的高浓度底物造成的高 渗透压抑制；发酵后期的高浓度乙醇造成的毒害抑制；发酵过程中不易控制的高溫度造成 的抑制作用。运些问题的存在成为限制浓膠发酵技术生产效率提高的主要因素。
[0004] 目前，对于酿酒酵母（Saccharomycescerevisae)耐受高渗透压、高浓度酒精和高 溫的研究已取得了很多的进展，但相关耐受机制尚未研究清楚。因此，要想通过理性的改造 手段来提高S.cerevisiae对逆境的耐受性十分困难。尽管传统的菌种选育手段（如自然 筛选、诱变育种）在提高菌株对逆境耐受性方面已取得了一定的效果，但存在工作量大、存 在随机性等缺点。近年来，随着分子生物学和组学技术的快速发展，为大规模研究酿酒酵母 基因和乙醇发酵的关系提供了条件。
【发明内容】
阳〇化]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高酒精生产效率的方法，所述方法 是在ace2基因缺失株里过量表达HAC1基因提高酵母菌发酵生产酒精的效率。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是酿酒酵母工程菌。 阳007]在本发明的一种实施方式中，所述ACE2基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述HAC1基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述ACE2基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO. 3所 /J、-〇
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是在ace2单基因缺失的酿酒酵母中过表 达HAC1基因。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述ace2单基因缺失的酿酒酵母购自Invotrogen 公司，编号为Sc04146899_sl。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将HAC1基因片段克隆到表达质粒 PHAC181(JiangL，2004)上得到重组高表达质粒PHAC181-HAC1，再将重组质粒转化到ace2 单基因缺失株中进行表达。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒PHAC181是在YCplaclSl的SphI和 EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：Analyses of the effects of Rck2p mut曰nts on Pbs2p°°-induced toxicity in S曰cch曰romyces cervisi曰e identify曰MAP kinase docking motif, and unexpected functional inactivation due to acidic substitution of T379, Mol Gen Genomics, 2004, 271:208 - 219.
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培 养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的ODe。。为0. 4-0. 5,于28-30°C、200-220r/min培养 7-8小时后转为静置培养，静置培养50-5化。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培 养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的ODe。。为0. 5,于30°C、220r/min培养8小时后转为 静置培养，继续培养52h。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有葡萄糖lOOg/L、硫酸锭7. 5g/ ^憐酸二氨钟3. 5g/L、屯水硫酸儀0. 75g/l、酵母提取物0. 2g/L、组氨酸0. 02g/l、尿喀晚 0.02g/l、亮氨酸0.1 g/L。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述活化优选Yro培养基。在YPD固体培养基上划 线，于30°C培养2dW初步活化菌种，再转接至YTO液体培养基中，30°C、220r/min摇床培养 2化至饱和。
[0018] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种酒精生产效率提高的酿酒酵母工程 菌，所述酿酒酵母工程菌缺失了编码氨基酸序列如SEQIDNO. 3的ace2基因且过表达核巧 酸序列如沈QIDNO. 2的HAC1基因。
[0019] 所述酿酒酵母工程菌是在ace2单基因缺失的酿酒酵母中过表达HAC1基因。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 本发明利用在ace2单基因缺失的酿酒酵母菌株中过量表达HAC1基因而获得的工 程酵母菌株发酵生产酒精，相比于野生型空载对照菌株，发酵进行到5化时，乙醇产量提高 了 200.8%，酒精对菌体得率提高了 138.9%;相比于仅发生ace2单基因缺失的菌株，乙醇 产量提高了 13. 1%。本发明具有很好的工业应用价值和前景，同时为构建高产酒精的优良 酿酒酵母基因工程菌株提供了重要的信息。
【附图说明】
[0022] 图1 :菌体生物量比较图；其中ace2+HACl代表在ace2单基因缺失菌株中过量表 达HAC1而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株；
[0023] 图2 :乙醇产量比较图；其中ace2+HACl代表在ace2单基因缺失菌株中过量表达 HAC1而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株；
[0024] 图3 :乙醇得率比较图；其中ace2+HACl代表在ace2单基因缺失菌株中过量表达 HACl而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株。
【具体实施方式】
[0025] 高效液相色谱测定乙醇含量的方法：发酵液中乙醇含量的测定采用高效液相色谱 仪（册LC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光 检测器）进行检测，液相色谱方法如下：色谱柱：Shodex甜1011糖柱有机酸柱；柱溫：50°C; 流动相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，经0. 22μπι滤膜过滤并除气；流速：1血/min;检测时间： 17min;进样量：20yL。
[0026] 乙醇对菌体得率