猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及用图
【技术领域】
[000。 本发明设及一种猪PPAR丫（pPPAR丫）基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的构建方 法及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
【背景技术】
[0002] 过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisomeproliferators-activeted rec巧tors,PPARs)属于核激素受体超家族成员，是一类由配体激活的转录因子。近年来 许多研究表明，PPARs在脂肪细胞分化、脂肪代谢中具有重要的调节作用，同时可W影响 一些脂肪因子的分泌。PPARs有3种亚型，分别是PPARα(NR1C1)、PPARβ/δ(NRC2)和 PPAR丫（NRC3)。PPAR丫主要在脂肪组织、巨隧细胞、血管平滑肌中表达。PPAR丫是脂肪细胞 基因表达和膜岛素细胞间信号转导的主要调节者，参与脂肪细胞分化和糖脂代谢的调节， 与肥胖的发生、发展密切相关。因此，开展PPAR丫在动物脂肪代谢和肌肉发育中的功能研 究具有重要的意义。
[0003]RNA干扰（RNAinterference,RNAi)是近年迅速发展起来的一项基因阻断技术， 它是指由21~23碱基对的短双链RNA、即小干扰RNA(smallinte计eringRNA，siRNA)在 真核细胞中引导序列特异性的内源或外源性祀mRNA降解，进而抑制相应基因表达的现象。 siRNA技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法，已广泛用 于基因功能、信号转导途径及肿瘤基因治疗等研究。由于干扰载体pSilencer4. 1-CMVneo 可W方便用于目的基因SiRNA表达载体的构建，从而可W特异性的使特定目的基因沉默， 功能丧失，因此干扰载体pSilencer4. 1-CMVneo可W作为一种强有力的研究工具，用于功 能基因组的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方法， W及该小干扰RNA表达载体的用途。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方 法，包括W下步骤：
[000引 1)、根据载体的信息和猪PPAR丫序列（猪PPAR丫全长基因序列）设计并合成4 对含9个核巧酸的loop环的SiRNA引物，所述9个核巧酸为：TTCAAGAGA;
[0007]目P，是根据载体的信息和祀序列设计并合成上述SiRNA引物；
[0008]2)、RNAi表达载体的构建：双酶切的RNAi载体与SiRNA引物退火后产物连接转 化，得到RNAi表达载体的重组质粒。
[0009] 作为本发明的pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为：根据 pPPAR丫全长基因序列，筛选并设计4对SiRNA引物；该4对SiRNA引物分别为：
[0010] 引物I:
[0011]8:5' -GATCCCTTTGGGATCAGCTCTGTGTTCAAGAGACACAGAGCTGATCCCAAAGTTA-3'
[0022] 作为本发明的pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤2) 为：将pSilencer 4. 1-CMV neo质粒进行BamH I和Hind III双酶切后，与siRNA引物退火 后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；得到RNAi表达载体的重组质粒。
[0023] 作为本发明的pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，将步骤2) 所得的RNAi表达载体进行鉴定：
[0024] 通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异 性上游引物（即，上述引物I~引物IV中的上游引物）和RNAi干扰载体的本身引物： 5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';测序引物为：5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。
[00巧]本发明还同时提供了按照上述方法所得的pPPAR丫小干扰RNA表达载体的用途： 用于抑制猪PPART基因的表达。具体为：用于研究pPPAR γ基因对猪脂肪代谢及关键基因 ATCL等产生的影响。
[0026] 作为本发明的猪PPAR丫小干扰RNA表达载体的用途的改进，包括W下步骤：
[0027](1)、将含pPPAR丫的SiRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；
[0028] (2)、将含pPPAR丫的SiRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞等细胞， 37°C，5%的C〇2中保溫4~化后更换不含抗生素的培养基；
[0029] (3)、转染4化后，分析SiRNA表达载体对pPPAR丫及脂肪代谢关键功能基因ATCL、 服L、PPAR丫等表达的影响，研究pPPAR丫的功能。
[0030] 本发明的pPPAR丫小干扰RNA表达载体的构建方法及其用途，具有W下有益效 果：
[0031] 本发明根据pSilencer4. 1-CMVneo载体信息和祀序列设计并合成了 4对siRNA 引物，siRNA引物经退火后与双酶切的pSilencer4. 1-CMVneo载体连接转化大肠杆菌 D册α，构建得到RNAi表达载体的重组质粒，经筛选和条件优化后，构建好的RNAi表达载 体对pPPAR丫具有较好的干扰效果。本发明是利用RNAi技术，开拓了目前研究猪脂肪代 谢调控和基因功能研究的新思路。此法所用的RNAi表达载体pSilencer4. 1-CMVneo vector方便易得，载体构建方法简单、可行，同时构建的RNAi表达载体能够特异、高效地抑 制pPPAR丫基因的表达，是研究pPPAR丫功能的一种强有力的研究技术，为开展pPPAR丫在 猪脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。
【附图说明】
[0032] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0033] 图1是siRNA引物退火后电泳检测图；
[0034] 图中：1 ---RSL2---RS2,3RS3,4RS4,5Control；
[0035]图 2 是BamHI/Hindlll消化pSilencer4. 1-CMV后的电泳检测图；
[0036] 图中：Μ---DNAmarker, 1 质粒，2---双酶切质粒；
[0037] 图3是PCR产物检电泳捡测图；
[0038] 图中：Μ-DMmarker;RS1~RS4 -阳性克隆PCR产物电泳结果；
[0039] 图4是质粒EcoRI和SamI双酶切产物凝胶电泳检测图；
[0040] 图中：Μ---DMmarker;1~4阳性克隆双酶切产物电泳结果；
[0041]图 5 是PPAR丫-siRNAl测序及BLAST 结果；
[0042]图 6 是PPAR丫 -siRNA2 测序及BLAST 结果；
[0043]图 7 是PPAR丫-siRNA3 测序及BLAST结果；
[0044]图 8 是PPAR丫 -siRNA4 测序及BLAST 结果；
[004引 图9是各干扰载体对pPPAR丫mRNA表达的影响（冲<0. 05 ;*冲<0. 01);
[0046]图 10 是pPPAR丫-siRNAl对pPPAR丫mRNA表达的影响图（*冲<0. 01);
[0047]图 11 是pPPAR丫-siRNAl对ATCL表达的影响图（*冲<0. 01);
[0048] 图12是pPPAR丫 -siRNAl对服L表达的影响图（*冲<0. 01);
[0049] 图13是RES和pPPAR丫 -siRNAl对pPPAR丫基因表达的影响图（冲<0. 05 ; *冲<0. 01);
[0050] 图14是RES和pPPAR丫 -siRNAl对pPPAR丫基因表达的影响图（冲<0. 05 ; *冲<0. 01);
[0051]图 15 是NAM和pPPAR丫-siRNAl对pPPAR丫 表达的影响图（冲<0. 05 ;*冲<0. 01);
[0052]图 16 是NAM和pPPAR丫-siRNAl对ATCL表达的影响图（冲<0. 05 ;*冲<0. 01)。
【具体实施方式】
[00閲 （一）、pPPAR丫的SiRNA表达载体的构建与鉴定
[0054] 1、祀序列选择：根据pPPAR丫全长基因序列，遵循化schl规则和Cenix规则设计 并筛选pPPAR丫的siRNA祀序列：
[00巧]PPAR丫-siRNAl:5'-AACTTTGGGATCAGCTCTGTG-3'
[0056]PPAR丫-siRNA2 :5,-AACAAACCTCACGAAGAGCCT-3，
[0057]PPAR丫-siRNA3 :5,-AAAGTCCTTCCCGCTGACCAA-3'
[0058]PPA