/LRES;PPAR丫 -SiRNA组，脂肪细胞转染PPAR丫的重组干扰载体 PPAR丫-siRNAl;RES+PPAR丫-siRNA组，DMEM/F12 培养基（不含血清和酪红）+50ymol/L RES,并转染PPAR丫-SiRNA1，每个处理Ξ个重复。转染4化后收集脂肪细胞，检测ATCL等基 因mRNA表达水平。
[0105] 结果表明，与对照组相比，RES处理后使PPAR丫的基因表达降低了 36.65 % (P<0. 01)，PPAR丫-siRNAl转染后使PPAR丫的基因表达降低了 55. 10 % (P<0. 01)， RES+PPAR丫-siRNAl处理后使PPAR丫的基因表达降低了 99.00% (P<0.01);与RES处理 组相比，PPAR丫 -siRNA组和RES+PPAR丫 -siRNA组的PPAR丫基因的mRNA水平分别降低了 29. 35% (P<0. 05)和 98. 43% (P<0. 01) ;RES+PPAR丫-siRNA组较PPAR丫-siRNA组PPAR丫 基因的mRNA水平降低了 97. 77% (P<0. 01)(图13)。
[0106] 与对照组相比，RES处理后使脂肪分解关键酶ATCL基因的mRNA水平提高了 495. 57% (P<0. 01)，PPAR丫-siRNAl转染后使ATCL的基因表达降低 35. 22% (P<0. 01)， RES+PPAR丫-siRNA处理后使ATCL的基因表达降低了 65.99% (P<0. 01);与RES处理组相 比，PPAR丫 -siRNA组和RES+PPAR丫 -siRNA组的ATCL基因的mRNA水平分别降低了 89. 12% (P<0. 05)和 94. 29% (P<0. 01) ;RES+PPAR丫-siRNA组较PPAR丫-siRNA组ATCL基因的mRNA 水平降低了 47. 50% (P<0. 01)(图 14)。
[0107](六）、NAM+PPAR丫-siRNAl对猪PPAR丫、ATCL等基因表达的影响
[0108]NAM100和PPAR丫 -SiRNAl协同调控ATCL等基因表达研究。将猪脂肪细胞传代培养 24h后，使其在转染日密度达70-95%进行处理。试验分成4个处理组：对照组（Control)， 转染空载体；NAM组，完全培养基（不含血清和酪红）+100μmol/LNAM;PPAR丫 -SiRNA组， 脂肪细胞转染PPAR丫的重组干扰载体PPAR丫-siRNAl;NAM+pPPAR丫-siRNA组，DMEM/F12 培养基（不含血清和酪红）+100μmol/LNAM，并转染PPAR丫-SiRNAl,每个处理Ξ个重复。 转染4化后收集脂肪细胞，检测ATCL基因mRNA表达水平。
[0109] 结果表明，与对照组相比，NAM处理后使PPAR丫的基因表达提高了 194.00% (P<0. 01)，PPAR丫-siRNAl转染后使PPAR丫的基因表达降低了 50. 00 % (P<0. 01)， NAM+PPAR丫-siRNA处理后使PPAR丫的基因表达降低了 72.50% (P<0.01);与NAM处理组 相比，PPAR丫 -siRNA组和NAM+PPAR丫 -siRNA组的PPAR丫基因的mRNA水平分别降低了 82. 99 % (P<0. 05)和 90. 65 % (P<0. 01) ;NAM+PPAR丫-siRNA组较PPAR丫-siRNA组PPAR丫 基因的基因表达差异不显著（图15)。
[0110] 结果表明，与对照组相比，NAM处理后使ATCL的基因表达降低了 29.30 % (P<0. 05)，PPAR丫-siRNAl转染后使ATGL的基因表达降低了 33. 72 % (P<0. 01)，NAM+PPAR丫-siRNA处理后使ATCL的基因表达降低了 57. 45 % (P<0. 01);与NAM处理 组相比，NAM+PPAR丫-siRNA组的ATCL基因的mRNA水平降低了 39. 82 % (P<0. 01); NAM+PPAR丫-siRNA组较PPAR丫-siRNA组ATCL基因的mRNA水平降低了 35. 80% (P<0. 01) (图 16)。
[0111] 最后，还需要注意的是，W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于W上实施例，还可W有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤： 1) 、根据载体的信息和猪PPARγ序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA 引物，所述9个核苷酸为：TTCAAGAGA; 2) 、RNAi表达载体的构建：双酶切的RNAi载体与siRNA引物退火后产物连接转化，得 到RNAi表达载体的重组质粒。2. 根据权利要求1所述的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是：所述 步骤1)为：所述4对siRNA引物为： 引物I: S:5'-GATCCCTTTGGGATCAGCTCTGTGTTCAAGAGACACAGAGCTGATCCCAAAGTTA-3， AS:5'-AGCTTAACTTTGGGATCAGCTCTGTGTCTCTTGAACACAGAGCTGATCCCAAAGG-3' ， 引物II: S:5'-GATCCCAAACCTCACGAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGTTA-3， AS:5'-AGCTTAACAAACCTCACGAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGG-3' ， 引物III: S:5'-GATCCAGTCCTTCCCGCTGACCAATTCAAGAGATTGGTCAGCGGGAAGGACTTTA-3， AS:5'-AGCTTAAAGTCCTTCCCGCTGACCAATCTCTTGAATTGGTCAGCGGGAAGGACTG-3' ， 引物IV: S:5'-GATCCGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTGAGAAACTCCCTTA-3， AS:5'-AGCTTAAGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTGAGAAACTCCCG-3' 。3. 根据权利要求2所述的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是：所述 步骤2)为：将pSilencer4. 1-CMVneo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA 引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；得到RNAi表达载体的重组质粒。4. 根据权利要求1~3中任意一种猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征 是：将步骤2)所得的RNAi表达载体进行鉴定： 通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上 游引物和RNAi干扰载体的本身引物：5 ^ -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3 ^ ;测序引物为： 5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3r 〇5. 如权利要求1~4中任意一种方法所得的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的用途，其 特征是：用于抑制猪PPARy基因的表达。6. 如权利要求5所述的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的用途，其特征是： 用于研究猪PPARγ基因对猪脂肪代谢及关键基因ATGL产生的影响。7. 根据权利要求6所述的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的用途，其特征是包括以下步 骤： (1) 、将含猪PPARγ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒； (2) 、将含猪PPARy的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞等细胞， 37°C，5%的C02中保温4~6h后更换不含抗生素的培养基； (3) 、转染48h后，分析siRNA表达载体对猪PPARγ及脂肪代谢关键功能基因ATGL、 HSL、PPARγ等表达的影响，研究猪PPARγ的功能。
【专利摘要】本发明公开了一种猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)、根据载体的信息和猪PPARγ序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，所述9个核苷酸为：TTCAAGAGA；2)、RNAi表达载体的构建：双酶切的RNAi载体与siRNA引物退火后产物连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。本发明还同时公开了上述猪PPARγ小干扰RNA表达载体的用途：用于抑制猪PPARγ基因的表达；特别是用于研究猪PPARγ基因对猪脂肪代谢及关键基因ATGL等产生的影响。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/85
【公开号】CN105255943
【申请号】CN201510685782
【发明人】单体中, 任阳, 汪以真
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月21日