基于转opn基因诱导的肝细胞体外增殖方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，涉及肝细胞体外增殖技术，具体涉及一种基于转0ΡΝ基因诱导的肝细胞体外增殖方法。
【背景技术】
[0002]肝脏作为人体的重要器官，担负着合成和分泌胆汁、代谢、解毒和维持内环境稳定等多种功能。许多理化因素、生物因素等可损伤肝脏，导致肝细胞再生受阻，肝脏结构受到破坏，产生一系列肝脏疾病。晚期肝脏疾病(肝硬化、肝癌)的5年生存率仅为14%。当前治疗终末期肝脏疾病主要有肝脏整体移植和干(肝)细胞移植等途径，然而，肝移植由于肝源缺乏和免疫排斥、干细胞移植由于各种研究瓶颈和缺陷而限制其应用，但成熟肝细胞移植却为等待供肝源的患者提供了过渡性治疗，并开始应用于肝急性损伤和先天性肝脏疾病。所以，目前对功能完善的肝细胞有较高的需求，其中，肝细胞的数量及其增殖能力对其移植后肝脏疾病的恢复具有重要的意义。体外分离、培养的原代肝细胞虽具有较完整的肝细胞功能，但体外培养中难以增殖和长期维持肝细胞的功能。因此，提高肝细胞体外增殖能力是解决肝细胞来源匮乏的一个重要方向，目前实现肝细胞体外增殖的策略有在培养基中添加生长因子、激素或化学物质等。
[0003]骨桥蛋白(osteopontin,0ΡΝ)，又称分泌磷蛋白 1 (secreted phosphoprotein1, SPP1 )，早期 T 细胞活化因子 1 (early T-cell activat1n factor, Eta_l)等，是一种带负电荷的分泌型磷酸化糖蛋白，属于Thl细胞因子成员。经对现有技术文献的检索发现:在病理过程中，0ΡΝ通过作用于自然杀伤性T细胞、中性粒细胞、肝星形细胞和肝癌细胞而参与促进炎症反应、细胞活化、增殖或迀移，从而在肝炎、肝纤维化或肝癌的发生中发挥重要作用。其中，日本的一个课题组通过体内研究发现0ΡΝ在肝再生中参与诱导卵圆细胞的活化和增殖。刘莹莹等也证实了 0ΡΝ能够促进卵圆细胞的增殖。在肝损伤引起的肝纤维化中，0ΡΝ参与促进肝星形细胞的活化和增殖。此外，0ΡΝ能通过自分泌和旁分泌诱导树突状细胞的成熟。
[0004]在现有技术下检索与本发明主题相关的文献与报道发现，俞燕等公开了 0ΡΝ对于化学性或药物性肝损伤具有明显的保护作用，但Sahai等在非酒精性脂肪肝的小鼠模型中发现，0ΡΝ促进肝细胞释放谷丙转氨酶(ALT)而导致肝脏受损。王晓东等人报道，重组人0ΡΝ(rhOPN)可显著抑制小鼠原代肝细胞的体外增殖，而闻衍凯等人发现不同浓度的重组大鼠OPN (rmOPN)处理对小鼠原代肝细胞的增殖没有影响。为此，我们通过腺病毒载体将大鼠0ΡΝ基因导入大鼠原代肝细胞中，并达到了体外促进肝细胞增殖的效果。
【发明内容】
[0005]本发明为克服体外给予重组0ΡΝ对肝细胞增殖作用不良的现状，提供了一种基于转0ΡΝ基因诱导的肝细胞体外增殖方法，即通过转0ΡΝ基因从而促进肝细胞的体外增殖，拓展了骨桥蛋白在肝细胞增殖方面的新用途，进而能够用于肝组织工程中肝细胞的扩增或进一步用于体内治疗，达到促进肝细胞增殖的效果。
[0006]本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，基于转0ΡΝ基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于通过腺病毒载体将大鼠0ΡΝ基因导入大鼠原代肝细胞中诱导其体外增殖，其中大鼠0ΡΝ基因(GeneBank登录号AB001382)序列为:
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[0007]本发明所述的基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于具体步骤为:(1)大鼠0ΡΝ基因的获得，通过PCR方法从大鼠再生肝组织中获得0ΡΝ基因的开放阅读框(0RF)片段，并对产物进行双酶切；(2)重组腺病毒载体的构建，对腺病毒载体pHBAd-MCMV-RFP进行双酶切，将酶切好的0ΡΝ基因的0RF片段与酶切载体连接，通过转化、筛选阳性克隆和摇菌后提取含有0ΡΝ基因的重组质粒；(3)腺病毒的包装与扩增，采用脂质体法将重组0ΡΝ质粒和骨架质粒共转染293细胞后收毒并扩增，对第三代病毒进行感染性滴度测定；(4)大鼠原代肝细胞的分离与培养，采用两步灌流法分散肝脏细胞，用体积浓度为60% Percoll离心法分离、纯化肝细胞，并铺于胶原蛋白预处理的培养板上培养；(5)腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染，按照M0I=50的比例加入腺病毒颗粒侵染大鼠原代肝细胞以诱导肝细胞的体外增殖。
[0008]本发明提供的方法成本低廉，操作简单，能够达到较好的肝细胞体外增殖效果。
【附图说明】
[0009]图1是过表达大鼠0ΡΝ基因对肝细胞活力的影响图；
图2是过表达大鼠0ΡΝ基因对肝细胞周期分布的影响图；
图3是过表达大鼠0ΡΝ基因对肝细胞增殖能力的影响图。
【具体实施方式】
[0010]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
[0011]第一部分腺病毒载体的构建
1.0ΡΝ基因0RF片段的PCR扩增、回收与酶切
按照Higgins和Anderson创立的方法建立经典的大鼠2/3部分肝脏切除模型，并取72h再生肝组织为实验材料，用Invitrogen公司的Trizol试剂提取72h肝组织的总RNA，采用Promega的AMV反转录试剂盒将2 μ g总RNA反转录成cDNA。以合成的第一链cDNA为模板，以 OPN-F: acacgcggccgcATGAGACTGGCAGTGGTTTGC 冷 Not I 酶切位点)和 OPN-R:acacatgcatTTAATTGACCTCAGAAG (含Afei I酶切位点)为上下游引物，用Τ0Υ0Β0的高保真酶KOD plus在57°C的退火温度下进行30个PCR循环，以扩增0ΡΝ基因的0RF区。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分离检测，后用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收0ΡΝ的0RF片段。随后对彡1 μ g的回收产物在37°C下进行Not I和NsiI的双酶切3h，酶切完成后对产物进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收和纯化。
[0012]2.pHBAd-MCMV-RFP载体的酶切与回收
将< 1 μ g的pHBAd-MCMV-RFP质粒载体在37°C下用Abi I和Nsi I进行双酶切3h，酶切完成后同样对酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，接着进行载体片段的胶回收和纯化。
[0013]3.重组质粒的构建与鉴定
将酶切均完成的0ΡΝ基因0RF与载体在16°C连接过夜连接(16-18h)，通过转化DH5a感受态细胞、平板挑菌和过夜摇菌，将菌液PCR鉴定为阳性的单克隆送测序鉴定，将经鉴定成功的重组质粒简化命名为pAd-OPN，同时也做空载pHBAd-MCMV-RFP对DH5a的转化和阳性克隆筛选，并命名为pAd-RFP，作为阴性对照载体。
[0014]第二部分0ΡΝ过表达腺病毒的生产 1.大量制备重组质粒
将对数生长期的pAd-OPN菌液和pAd-RFP.菌液2mL分别加入100mL含100 μ g/mL Amp的LB培养基中，37°C 300rpm震荡摇菌过夜，采用北京康为世纪生物科技有限公司的中提质粒试剂盒提取质粒。
[0015]2.重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增
转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为含10% (v/v) Hyclon胎牛血清的DMEM培养基，置37°C含体积浓度为5%的C02培养箱中培养过夜。待细胞生长的汇合率为70%-80% (面积比)时，取腺病毒质粒pAd-OPN和pAd-RFP，分别与骨架质粒pHBAd_BHG组合，并用Invitrogen的Lipofectamine 2000转染试剂共转染293细胞。转染6h后，更换细胞培养液。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。即将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15mL离心管中，将15mL离心管在液氮及37°C水浴反复冻融三次后，3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为0ΡΝ过表达腺病毒第一代毒种，将作为随后大量病毒扩增的毒种。从P1代病毒上清(约3mL左右)中取2mL去感染10cm细胞培养皿的细胞(细胞汇合率90%以上)。余下的病毒上清放入冻存管中_80°C保留，作为毒种保留。病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15mL离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于-80°C保存。如此操作得到第二代和第三代病毒。
[0016]3.感染性滴度检测
采用改进的TCID50法对第三代腺病毒的滴度进行测定。测定结果为1 X 1010PFU/mL,体积lmL，总滴度为:1X101Q PFU。
[0017]第三部分大鼠原代肝细胞的分离
将质量浓度为3%的戊巴比妥钠溶液按照1.5mL/kg腹腔注射大鼠，用体积分数为75%的酒精消毒腹部皮肤，十字打开腹腔，暴露肝门静脉，插管，结扎肝上