一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及发酵培养领域，更具体地说设及一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法。
【背景技术】
[0002] 培养基是提供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的 多种营养物质的混合物，为获得高品质、高浓度的生物制品，必须要有营养丰富完备、组成 合理、质量稳定，能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力。
[0003] 副鸡禽杆菌的生命特性比较脆弱，是一类酶系统不完全的革兰氏阴性杆菌，生长 不仅需要丰富的碳源和氮源，还需要健康动物血清、酵母浸出液及辅酶等特殊营养物质，而 且培养条件苛刻，给菌液的发酵培养带来困难，目前副鸡禽杆菌的扩大培养所获得活菌数 不高，且培养周期长。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种副鸡禽杆菌菌液的培养方 法。 阳〇化]为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0006] 一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，包括W下步骤：（1) 一级种子液的制备；（2)二 级种子液的制备；（3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的二级种子液为副鸡禽杆 菌WF株或YC株二级种子液，所述的扩大培养后各菌株活菌数均> 4. 5Xl〇9CFU/mL。
[0007] 进一步地，所述的扩大培养中副鸡禽杆菌二级种子液接入量为5% (V/V)。
[0008] 进一步地，所述的扩大培养所用培养基为半合成培养基。
[0009] 进一步地，所述的半合成培养基的抑值为7. 2~7. 6。
[0010] 进一步地，所述的扩大培养为通气培养，通气量为5~6L/分钟。
[0011] 进一步地，所述的扩大培养条件为揽拌速度100~200转/分，培养溫度为37°C， 培养时间为16-1化。
[0012] 本发明的有益效果在于：该培养工艺所获得菌株活菌数高，且生产周期短，对疫苗 的产业化生产工艺有很大的提高和改善。
【具体实施方式】
[0013] 下面详细说明本发明的具体实施，有必要在此指出的是，W下实施只是用于本发 明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。
[0014] 菌种：副鸡禽杆菌WF株和YC株，由山东华宏生物工程有限公司提供。
[0015] 培养基：半合成培养基，由山东华宏生物工程有限公司实验室自制。
[0016] 发酵罐：4化微生物发酵罐，购自上海高机生物工程有限公司。
[0017] 实施例1二级种子液的制备
[0018] 将副鸡禽杆菌WF株或YC株的一级种子划线接种于鸡肉汤琼脂平板，在含5%~ 10% %的条件下，37°C培养16~1她，选巧光性强的典型菌落接种于鸡肉汤培养基中，置 37°C培养16~20h，经纯检合格后，即为二级种子，在2~8°C保存，不得超过6~化。
[0019] 实施例2二级种子接种量对制苗菌液浓度的影响
[0020] 半合成培养基中，分别按1%、2%、3%、5%的接种量（￥八）接种副鸡禽杆菌￥尸株 或YC株的二级种子液，37°C培养20h，分别对不同时间段的菌液进行活菌计数，比较二级种 子不同接种量对制苗菌液浓度的影响。 阳02U 不同二级种子接种量对副鸡禽杆菌WF株或YC株菌液培养浓度有一定影响，详细 结果见表1和表2。
[0022] 表1不同二级种子接种量对WF株菌液浓度的影响
[0024] 表2不同二级种子接种量对YC株菌液浓度的影响
[0026] 由表1和表2可知，在培养基中接种5%含量的二级种子，可W在较短时间内获 得较好的培养效果，生产周期和生产工艺考虑，选择5%接种量为适宜接种量，培养时间为 16-1 化。
[0027] 实施例3不同培养方式对制苗菌液浓度的影响
[0028] 分别W静置培养及通气培养方式，测定不同菌液培养方式对菌液浓度的影响。通 气培养时开始小量通气，逐渐增大通气量，通气量控制在5~6L/分钟，37°C条件下培养 1她，分别对12h、1化和1她的时间点取样进行活菌计数，比较不同菌液培养方式对菌液浓 度的影响。
[0029] 静置培养与通气培养对WF株或YC株培养菌液活菌计数存在较大影响，详细结果 见表3。
[0030] 表3静置培养与通气培养的培养菌液活菌计数结果（Xl〇9cFU/mL)
[0031]
[0032] 副鸡禽杆菌在培养增殖过程中，产生的代谢产物富集，抑制菌体的生长增殖，通气 培养在培养过程中不断输入新鲜空气，调整培养基的营养成分、均匀度及抑值，因此对副 鸡禽杆菌进行通气培养的优点是明显的。
[0033] 实施例4微生物发酵罐扩大培养条件的优化
[0034] 按发酵罐最小装量加入半合成培养基，按培养基总量的5% (V/V)加入副鸡禽杆 菌WF株或YC株的二级种子液，进行微生物发酵罐单独扩大培养，溫度控制在37°C，调节揽 拌转速、抑值、通气量，培养1她，进行活菌计数，比较不同培养条件下副鸡禽杆菌的菌液浓 度。
[0035] ①不同揽拌速度对菌液浓度影响的试验结果
[0036] 在利用微生物发酵罐培养副鸡禽杆菌WF株或YC株的过程中，揽拌速度可显著增 加菌液的浓度，但副鸡禽杆菌较脆弱，过高的揽拌速度可影响其生长增殖，因此综合各种因 素，我们将微生物发酵罐培养时，揽拌速度控制为100~200转/分钟，详细结果见表4。
[0037] 表4微生物发酵罐不同揽拌速度对菌液终浓度的影响（XlO9CFlVmL)
[0039] ②不同通气量对菌液浓度影响的试验结果
[0040] 在微生物发酵罐培养副鸡禽杆菌WF株或YC株的过程中，不断输入新鲜空气，并排 除细菌产生的气体，及时调整培养基营养成分的均匀度及抑值，对细菌浓度影响较大，通 过试验结果我们认为5~6L/分钟的通气量较好，详细结果见表5。
[0041] 表5不同通气量对菌液终浓度的影响
【主权项】
1. 一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，包括以下步骤：（1) 一级种子液的制备；（2)二级 种子液的制备；（3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的二级种子液为副鸡禽杆菌 WF株或YC株二级种子液，所述的扩大培养后各菌株活菌数均多4. 5X109CFU/mL。2. 根据权利要求1所述的一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，其特征在于，所述的扩大 培养中副鸡禽杆菌二级种子液接入量为5 % (V/V)。3. 根据权利要求1所述的一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，其特征在于，所述的扩大 培养所用培养基为半合成培养基。4. 根据权利要求3所述的一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，其特征在于，所述的半合 成培养基的pH值为7. 2~7. 6。5. 根据权利要求1所述的一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，其特征在于，所述的扩大 培养为通气培养，通气量为5~6L/分钟。6. 根据权利要求5所述的一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，其特征在于，所述的扩大 培养条件为搅拌速度1〇〇~200转/分，培养温度为37°C，培养时间为16-18h。
【专利摘要】本发明提供了一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法，属于发酵培养领域，其培养步骤：(1)一级种子液的制备；(2)二级种子液的制备；(3)微生物发酵罐扩大培养；其中，所述的二级种子液为副鸡禽杆菌WF株或YC株二级种子液，所述的扩大培养后各菌株活菌数均≥4.5×109CFU/ml。本发明所获得各菌株活菌数高，培养周期短，为副鸡禽杆菌规模化生产合格菌液提供了良好的工艺基础，同时对疫苗的产业化生产工艺有很大的提高和改善。
【IPC分类】C12N1/20
【公开号】CN105296407
【申请号】CN201510896740
【发明人】王永明, 朱万光, 王晓丽, 张效伟, 于海光, 牛卫卫, 赵飞飞, 李士成
【申请人】山东华宏生物工程有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月7日