gt;0. 05,CallFreq〉0. 9,并且不全为杂合的SNP位点， 共计21171个。
[0036] 1. 4陆地棉基因组序列数据库
[0037] 以陆地棉（TM-1)基因组测序获得的序列数据（序列版本号：Gossypium_hirsutum vl. 〇)作为输入序列，利用BLAST+程序的makeblastdb命令构建本地基因组序列数据库，利 用blastn命令将上述21171个SNP位点的原始序列与构建的基因组序列数据库进行同源 比对，筛选比对结果中E值小于-18,并且只有一个比对结果的单拷贝SNP位点。
[0038] 1.5SNP基因型统计
[0039] 根据芯片杂交分型结果，进一步筛选1. 4中的单拷贝SNP位点，根据这些SNP位点 的芯片杂交分型结果对120份材料进行基因型分析。可选择地，SNP基因型分析除了利用芯 片杂交结果之外，还可以通过对样本材料DNA中SNP位点对应序列进行测序（因本发明的 SNP位点为单拷贝，不会存在同源序列的干扰，故测序成功率会大大提高），具体测序方法 如下：根据SNP位点对应序列设计正向引物和反向引物，以样本材料DNA为模板，在PE9600 上进行PCR扩增，扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳，用乙醇沉淀法对PCR产物进行纯化，纯 化后溶于适量TE缓冲液中备用。PCR产物用DNA测序试剂盒（(BigDyeTerminatorCycle SequencingReadyReactionKit，PE公司）进行双向测序反应，使用ABI310DNA测序仪 进tx序列测定。
[0040] 1. 6连锁不平衡分析
[0041] 根据1. 5中120份材料的基因型结果，利用TASSEL软件分别对26条染色体上的 单拷贝SNP位点进行连锁不平衡分析，获得不同染色体的连锁不平衡分布情况（图1)，进一 步根据连锁不平衡分析结果，首先剔除掉处于完全连锁不平衡状态（R2= 1)的SNP位点， 然后利用SPSS软件的非线性回归模型绘制标记间的连锁不平衡曲线，确定棉花26条染色 体上的连锁不平衡衰退距离，进一步剔除掉位于连锁不平衡衰退距离内的SNP标记，从而 获得本发明的SNP标记（表2)。
[0042] 本发明开发的陆地棉基因组SNP标记及其核苷酸类型和染色体定位见表2。
[0043] 表2本发明开发的陆地棉基因组SNP标记及其序列和染色体定位
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048」
[00*y」
[0050]
[0051]
[ΟΟοζ」
[oow」
[0〔-、
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060」
[0061]
[0062]
[0063]
[OGui」
[Ov/u?j」
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[00/Uj
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[00-.
[0076]
[00//」
[0078]
[0079]
[0080]
[0(
[0082] 1. 7遗传多样性分析和群体结构分析
[0083] 利用表2中的SNP标记对表1的120份材料进行基因型分析，方法同步骤1. 5。利 用PowerMarke3. 25 软件（LiuKJ,MuseSV(2005)PowerMarker:anintegratedanalysis environmentforgeneticmarkeranalysis.Bioinformatics21:2128 - 2129.)对材料进 行遗传多样性分析，利用软件的"smnmarystatistics"程序计算每个SNP位点的等位基因 数目、等位基因频率、基因多样性和多态性信息含量，利用"phylogeny"程序进行NJTREE 聚类分析（图2)。
[0084]利用STRUCTURE2. 2 软件（PritchardJK,StephensM,DonnellyP(2000)Inference ofpopulationstructureusingmulti-locusgenotypedata.Genetics155:945 -959.)对样本进行结构分析，利用软件的'admixturemodel'进行程序运行，选择length ofburninperiod为 1000，NumberofMCMCRepsafterburnin为 1000,其他为默认，群 体参数k值选择1-15,每个k独立重复5次。根据每个K值的可能性（(Ln(k))绘制delta k(deltak=m(Ln"（k))/S(Ln(k)))的变化图（图 3)，选择K= 2 时的barplot图为理想 的群体结构（图4)。
[0085] 利用本发明的标记对120份陆地棉材料进行遗传多样性分析时，全部的4074个 SNP标记在120份材料间均检测到多态性，检测效率达到100 %，平均每个SNP标记可以检 测到2个等位基因，检测到的等位基因频率围在0. 5~0. 95,平均为0. 75 ;检测到的基因多 样性范围在0. 1~0. 5,平均为0. 34 ;检测到的PIC值范围为0. 09~0. 38,平均为0. 27。 聚类分析可以明显地将这120份材料按照遗传距离的远近分成不同类群，群体结构分析表 明这120份材料存在明显的群体结构。
[0086] 1.8利用SNP标记进行种质鉴定
[0087] 根据对表1的120份材料进行基因型分析的结果，分析不同材料所具有的特征SNP 标记，利用特征SNP标记对不同材料进行SNP基因型检测，即可获得该材料的特征SNP基因 型，从而将该材料与其它材料区分开。
[0088] 具体地，特征SNP标记的获取方法如下：首先利用表2的SNP标记对120份材料进 行遗传多样性分析，选择SNP位点的等位基因频率大于0. 9的SNP标记，分析这些SNP标记 在120份材料中的SNP基因型，如果只利用某一个SNP标记即可以将某一种质材料与其它 种质材料区分开，则该SNP标记即为该种质材料的特征SNP标记（表3)。
[0089] 在具体实施时，利用表4中的特征SNP标记对特定种质材料进行SNP基因型检测， 可以快速筛选出具有特征SNP标记基因型的种质材料（表4)。
[0090] 表3不同种质材料的特征SNP标记
[0091]
[0092] 表4不同种质材料的特征SNP标记基因型 「00931
[0094] 利用本发明的SNP标记对不同种质材料进行指纹图谱鉴定时，通过筛选针对不同 种质材料鉴定的特征SNP标记，可以实现利用1个SNP标记对特定种质材料进行鉴定的目 的。
【主权项】
1.陆地棉SNP标记，其特征在于，所述SNP标记包括：2. 按照权利要求1所述的陆地棉SNP标记，其特征在于：所述SNP标记为i00326Gh、 i03099Gh、 i02807Gh、 i03003Gh、 i00827Gh、 i03528Gh、 i04354Gh、 i03143Gh、 i00950Gh、 i00546Gh、i01389Gh、i01439Gh、i01985Gh 或 i03302Gh 中的任意一种或多种。3. 按照权利要求1或2所述的陆地棉SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的位点的 物理位置是基于陆地棉TM-I基因组测序序列确定的；其中，所述陆地棉TM-I基因组测序序 列的版本号为：Gossypium_hirsutum vl.O。4. 用于检测权利要求1或2所述陆地棉SNP标记的引物对。5. 权利要求1或2所述的陆地棉SNP标记在陆地棉的遗传多样性分析或群体结构分析 中的应用。6. 按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测陆地棉的基因组DNA ; (2) 利用权利要求4所述的引物对，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物； (3) 对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果； (4) 根据测序结果，确定待测陆地棉在所述SNP标记的位点的基因型；然后进行陆地棉 的遗传多样性分析或群体结构分析。7. 权利要求1或2所述的陆地棉SNP标记在陆地棉的种质鉴定中的应用。8. 按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测陆地棉的基因组DNA ; (2) 利用权利要求4所述的引物对，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物； (3) 对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果； (4) 根据测序结果，确定待测陆地棉在所述SNP标记的基因型； (5) 如果待测陆地棉在所述SNP标记的基因型与权利要求1或2所述陆地棉SNP标记 的基因型相同，则鉴定为同一陆地棉品种；反之，则鉴定为不同陆地棉品种。9. 一种陆地棉SNP芯片，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的陆地棉SNP标记。10. 权利要求9所述的陆地棉SNP芯片在陆地棉的遗传多样性分析、群体结构分析或种 质鉴定中的应用。
【专利摘要】本发明公开了陆地棉SNP标记及其应用，属于陆地棉SNP标记的开发领域。本发明通过利用芯片杂交和同源序列比对的方法开发出陆地棉基因组单拷贝SNP标记，进一步通过连锁不平衡分析剔除掉位于连锁不平衡衰退距离内的SNP标记，从而获得本发明陆地棉SNP标记。本发明所述SNP标记能够应用于陆地棉的遗传多样性分析或群体结构分析，或者应用于陆地棉的种质鉴定。本发明陆地棉SNP标记为单拷贝并且标记间不存在显著的连锁不平衡，因此，应用本发明陆地棉SNP标记在进行遗传多样性分析、群体结构分析或指纹鉴定时的检测效率大大提高，工作效率更高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C40B40/06
【公开号】CN105349537
【申请号】CN201510869797
【发明人】赵云雷, 王红梅, 陈伟, 赵佩, 龚海燕, 桑晓慧, 崔艳利
【申请人】中国农业科学院棉花研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月2日