7.1)用 66L 的含 1.5mol/L (順4)#04的 0.2mol/L，PH3_8 的 NaAc-HAc 缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
7.2)将透析液流经此柱，流速控制在3mL/min左右；
7.3)平衡后，用1.5mol/L的(NH4)2S04溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；
7.4)再用不含(册14)2304平衡缓冲液洗脱，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，-20°C保存。
[0024]8)冻干
用2mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0，装盘、冻干，得糜蛋白酶9.3kg。
[0025]经检测，所得糜蛋白酶效价约为1666iu/mg。
[0026]实施例2 1)多重结晶
1.1)结晶I
将28kg糜蛋白酶原投入反应罐中，加入196L纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸500mL搅拌8小时后，再用2.5mol/L硫酸调节pH值至2.5 ;加入饱和硫酸铵溶液56L，搅拌15分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至4.5，置于25°C条件下，恒温48小时后过滤，收集滤饼23.2kg ；
1.2)结晶II
将所得滤饼投入反应罐中，加69.6L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol/L硫酸调节pH值至3.0 ;加23.2L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至5.0，置于25 °C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼20.2kg ；
1.3)结晶III
将所得滤饼投入反应罐中，加60.6L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol/L硫酸调节pH值至3.5 ;加20.2L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至5.5，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼15.1kg，滤液作母液回收；
1.4)母液回收III
量取母液体积81.6L，用2.5mol/L硫酸调节pH值至2.5，加入固体硫酸铵24.89kg，搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.3kg ;1.5)结晶IV
将所得滤饼投入反应罐中，加52.2L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol/L硫酸调节pH值至2.5 ;加17.4L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至5.0，置于25 °C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼12.6kg，滤液作母液回收；
1.6)母液回收IV
量取母液体积70.1L，用2.5mol/L硫酸调节pH值至3.5，加入固体硫酸铵21.38kg，搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.2kg。
[0027]2)活化
将所得滤饼投入反应罐中，加44.4L纯化水溶解，加2.5mol/L硫酸助溶，用5mol/LNaOH调节pH值至7.0 ;加入14.8L磷酸缓冲液，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至7.5，得料液60.5L。加入胰蛋白酶晶体12.lg，置于4°C冰箱中，两天后用5mol/L NaOH调节pH值至8.0，得活化液58.4L。
[0028]3)盐析
上述活化液用2.5mol/L硫酸调节pH值至4.0，加入固体硫酸钱29.2kg，静置过夜，次日过滤，收集滤饼12.2kg。
[0029]4)超滤
将所得滤饼投入反应罐中，加入磷酸盐缓冲液183L，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至8.5，待液体超滤，体积控制在3/10，得超滤液185L。
[0030]5)热原处理
5.1)取上述超滤液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸钠溶液18.5L，在不断搅拌下缓缓加入lmol/L醋酸钙溶液11.1L;
5.2)用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，稳定后继续搅拌1.5小时，结束后，离心20分钟，弃去沉淀物，得滤液178L。
[0031]6)透析工序
取上述滤液，透析液扎包(100mL/包)，将透析袋放入4°C纯化水中，进行透析交换5天，每24小时换一次纯化水。
[0032]7)亲和层析
7.1)用 60L 的含 2mol/L (NH4)2S04^ 0.15mol/L，PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
7.2)将透析液流经此柱，流速控制在2mL/min左右；
7.3)平衡后，用lmol/L的(NH4)2S04溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；
7.4)再用不含(册14)2304平衡缓冲液洗脱，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，-20°C保存。
[0033]8)冻干
用2mol/L NaOH溶液调节pH值至6.5，装盘、冻干，得糜蛋白酶8.8kg。
[0034]经检测，所得糜蛋白酶效价约为1734iu/mg。
[0035]实施例3
取实施例2中制备的糜蛋白酶440万单位，称取15g甘露醇、水解明胶10g，加适量8°C注射用水溶解，混合后，并用0.05mol/L磷酸盐缓冲液调至调节pH值至5.8，然后再加注射用水至1000ml，聚醚砜超滤膜无菌过滤，分装于1000个已处理好的西林瓶中，冻干、乳盖即可。
[0036]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及提高糜蛋白酶复溶性的药物组合物，该方法包括:通过改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术，提高了纯化糜蛋白酶的效率，保持糜蛋白酶的效价稳定。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:以糜蛋白酶原为原料，依次经过多重结晶、活化、盐析、超滤、热原处理、透析、亲和层析、冻干等工序纯化得到糜蛋白酶。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述纯化工艺包括如下步骤: 1)糜蛋白酶原溶解后，加入饱和硫酸铵溶液，过滤，收集滤饼；溶解滤饼，结晶，母液回收，收集滤饼；改变结晶条件，重复结晶3次； 2)溶解滤饼，加磷酸盐缓冲液，加入活化剂活化； 3)活化液调节pH值后加入固体硫酸铵进行盐析，静置过夜，过滤，收集滤饼； 4)加入磷酸盐缓冲液搅拌调节pH值，超滤； 5)超滤液加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液后，调节pH搅拌，离心，弃沉淀物； 6)取上述滤液置于于透析袋中，透析4?6天； 7)亲和层析，用2种洗脱液进行洗脱，最终收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，_20°C保存； 8)调节pH值，装盘、冻干，得糜蛋白酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，为了减少蛋白活性的损失，溶解糜蛋白酶原和透析最好选用冰冷的纯化水，4 °C效果最佳。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，改变条件多次结晶，尤其是母液回收的工艺优化，提高了纯化糜蛋白酶的效率，更好的保持了蛋白的活性。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于多重结晶中还应进行必要的母液回收，并且硫酸铵??母液=305g:1L，活化工序中每lOOmL待活化液中加入胰蛋白酶5mg，盐析工序中每升活化液中加入500g硫酸铵。7.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析快胶柱包括:苯基-Sepharose 2B FF,苯基-Sepharose 4B FF,苯基-Sepharose 6B FF,苯基-SepharoseCL-2B FF,苯基-Sepharose CL-4B FF,苯基-Sepharose CL-6B FF。8.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析条件为:平衡液选用含0.5-3mol/L (順4)#04的 0.01-0.3mol/L，PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液，流速控制在 l~5mL/min左右，洗脱液选用0.5-3mol/L的(NH4) 2S04溶液和不含(NH 4) 2S04平衡缓冲液。9.如权利要求1?7所述的方法，其特征在于:亲和层析纯化所得糜蛋白酶效价高达1500 ?1800iu/mgo10.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-9制备的糜蛋白酶作为活性成分，还含有甘露醇、水解明胶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
【专利摘要】本发明公开一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及提高糜蛋白酶复溶性的药物组合物，该方法通过以下工艺步骤：（1）多重结晶;（2）活化；（3）盐析；（4）超滤；（5）热原处理；（6）透析；（7）亲和层析；（8）冻干，制备糜蛋白酶。本发明对糜蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的糜蛋白酶的效价高达1500～1800iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。
【IPC分类】A61K38/48, A61P29/00, A61P17/02, C12N9/76
【公开号】CN105400765
【申请号】CN201510806702
【发明人】刘乃山, 林晓磊, 刘翠珍
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月21日