一种甘露聚糖肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵和药用肽领域，涉及一种糖肽的制备方法，具体涉及一种甘露聚糖肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖肽曾用名为多抗甲素，是我国首创的一种生物免疫增强剂。它是由不同链长的甘露聚糖肽分子组合在一起形成的混合物，不存在小分子糖类和游离氨基酸，其主要结构为多肽链与甘露聚糖连接。现代药理及临床研究表明:甘露聚糖肽具有明显的生物活性，它可以调节机体免疫紊乱，显著增强自身免疫力。现较多用于治疗免疫功能低下或免疫障碍性疾病，如反复感冒、反复呼吸道感染、白细胞减少和肿瘤的辅助治疗以减轻放、化疗的不良反应等，并取得了较好的疗效，临床应用越来越广泛。
[0003]魔芋飞粉是在魔芋精粉加工过程中，飘落在周围的质量轻、颗粒小的细粉。魔芋飞粉中含有丰富的营养成分，蛋白质含量23.8%，水溶性糖分(甘露糖和葡萄糖)8.95%，是含高蛋白、低甘露聚糖的良好资源，但由于魔芋飞粉存在特殊的蛋腥味和臭味，目前主要用作动物饲料，利用率低。
[0004]目前，国内制备甘露聚糖肽主要从菌株培养液中提取，来源较单一。例如，专利申请号为03117579.1、发明名称为甘露聚糖肽及其制备工艺及用途的中国专利，是从α_溶血链球菌的发酵产物中分离提取精制而成甘露聚糖肽。专利申请号为200710093102.2、发明名称为高纯度甘露聚糖肽的制备方法的中国专利、以及专利申请号为200710093103.7、发明名称为甘露聚糖肽的制备方法的中国专利，均以α_溶血链球菌H1S-33号为菌株，进行液体发酵制备甘露聚糖肽。目前并未见到有以魔芋飞粉为原料制备甘露聚糖肽的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种甘露聚糖肽的制备方法，该方法以魔芋飞粉为原料，通过发酵得到甘露聚糖肽，该方法既能拓宽甘露聚糖肽的来源，又为魔芋飞粉的开发利用提供了一条新途径。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]—种甘露聚糖肽的制备方法，包括以下步骤:
[0008]1)发酵:向每lOOmL培养基中加入魔芋飞粉1?3g，采用栖土曲霉和地衣芽孢杆菌共生发酵，发酵完成后，发酵液经离心后去除菌体，取上清液，向其中加入1?5倍于上清液体积的纯化水，然后用三氯乙酸调节pH值至3.8?4.2，静置后去除沉淀，去除沉淀后得到的上清液即为魔芋糖肽液；
[0009]2)超滤:将魔芋糖肽液依次通过截留分子量为100KD及10KD的超滤膜，收集分子量在10?100KD区段的超滤液，得到甘露聚糖肽粗品；
[0010]3)用凝胶柱层析对甘露聚糖肽粗品进行分离纯化，即得到纯化的甘露聚糖肽。
[0011]所述步骤1)中的发酵工艺为:培养基的pH值为7.0?11.0，栖土曲霉与地衣芽孢杆菌的菌种比例为1: (1?3)，菌液浓度为5 X107?5 ΧΙΟ 9个/mL，接种量为4?12%，发酵时间为24?48h，发酵温度为25?38°C。
[0012]所述步骤1)中培养基是向每lOOmL蒸馈水中加入蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN030.1 ?0.4g、K2HP04 0.05 ?0.2g、KC1 0.02 ?0.lg、MgS04.7H20 0.02 ?0.lg 和 FeS04
0.002?0.0lg后得到的。
[0013]所述步骤1)中的发酵液在4°C下以8000?12000r/min的转速离心10?30min
后去除菌体。
[0014]所述步骤3)中使用的层析柱规格为(1.0?20) cmX (50?100) cm，内填物为Sephadex G_750
[0015]所述步骤3)中的凝胶柱层析条件为:上样量为3?300mL，样品浓度为100?200mg/mL，洗脱剂为蒸馈水，洗脱流速为0.5?80mL/min，每管收集3?6mL，在280nm和460nm处测定吸光值，收集合并同时具有糖、肽吸收峰的组分进行浓缩，真空冷冻干燥后得到纯化的甘露聚糖肽。
[0016]所述的真空冷冻干燥是在-110?-60°C及60?800Pa下干燥12?24h。
[0017]制得的甘露聚糖肽中所含的甘露糖和葡萄糖的质量比为1.7: (1?4)。
[0018]制得的甘露聚糖肽中所含的必须氨基酸的质量为氨基酸总质量的29.61%?31.26%。
[0019]制得的甘露聚糖肽中所含的氨基酸包括苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸。
[0020]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0021]本发明提供的甘露聚糖肽的制备方法，在培养基中加入魔芋飞粉，通过栖土曲霉和地衣芽孢杆菌共生发酵得到魔芋糖肽液；然后经过超滤得到甘露聚糖肽粗品；再经凝胶柱层析分离纯化得到纯化的甘露聚糖肽。本发明以魔芋飞粉为原料结合发酵法、超滤和色谱层析分离技术制备出甘露聚糖肽，发掘了魔芋飞粉的利用价值，拓宽了甘露聚糖肽的制备方法。运用本发明的方法，可以得到甘露聚糖肽，证实了魔芋飞粉是甘露聚糖肽的一种理想来源，填补了以魔芋飞粉为原料制备甘露聚糖肽的技术空白，既能拓宽甘露聚糖肽的来源，同时也为魔芋飞粉的开发利用、生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。
[0022]进一步的，对本发明制得的甘露聚糖肽的单糖、氨基酸成分进行了分析，证明制得的甘露聚糖肽中所含的单糖主要为甘露糖和葡萄糖，且甘露糖和葡萄糖的质量比为
1.7: (1?4)。并且通过检测发现本发明制得的甘露聚糖肽中含有苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸共17种氨基酸，其中必须氨基酸占氨基酸总量的29.61%?31.26%，具有很高的应用价值和市场前景。
【附图说明】
[0023]图1为甘露聚糖肽标准品的氨基酸图谱；
[0024]图2为本发明制得的甘露聚糖肽的氨基酸图谱；
[0025]图3为甘露糖、葡萄糖混合标准品的高效液相色谱图；
[0026]图4为本发明制得的甘露聚糖肽的单糖水解物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例来详细说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所做的修改或替代，均属于本发明的保护范围。
[0028]本发明提供了一种甘露聚糖肽的制备方法，以魔芋飞粉为原料，通过栖土曲霉和地衣芽孢杆菌共发酵法制备魔芋糖肽液；然后采用超滤的方法对魔芋糖肽液进行处理，收集相对分子质量在10?100KD的滤过液；将滤过液经凝胶柱层析分离，即可得到纯化的甘露聚糖肽。本发明填补了以魔芋飞粉为原料结合发酵法、超滤和色谱技术制备甘露聚糖肽的技术空白，同时也为魔芋飞粉的开发利用，生产高附加值产品开辟了一条新路，在食品、医药等领域具有重要意义。
[0029]下面结合具体的实施例对本发明进行进一步详细说明。
[0030]实施例1
[0031]1)发酵:将lg魔芋飞粉加入到发lOOmL酵培养基中，采用栖土曲霉和地衣芽孢杆菌进行共生发酵，发酵完成后，发酵液在4°C下经8000r/min离心30min去除菌体，上清液加3倍纯化水，三氯乙酸调pH至3.8，静置后去沉淀，上清液即为魔芋糖肽液。
[0032]其中，培养基的组成为:蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN03 0.2g、K2HP04 0.2g、KC10.08g、MgS04.7H20 0.04g、FeS04 0.004g，蒸馏水 lOOmL0 培养基的 pH 值为 7，栖土霉菌与地衣芽孢杆菌的菌种比例为1:1，菌液浓度稀释至5 X 107个/mL，接种量为10 % (V/V，接种量指的是单位体积的培养基中接入的菌液的体积分数)，发酵温度为30°C，发酵时间为30h。
[0033]2)超滤:将魔芋糖肽液依次通过截留分子量为100KD及10KD的超滤膜，收集分子量分布于10?100KD区段的超滤液。
[0034]3)采用规格为lcmX50cm的Sephadex G_75凝胶层析柱对超滤液进一步分离纯化。凝胶柱分离条件为:上样量3mL，样品浓度为150mg/mL，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为
0.5mL/min。每管收集5mL。收集合并280nm和460nm吸收峰处的组分，浓缩后在_60°C、60Pa下真空冷冻干燥15h，即可得到纯化的甘露聚糖肽。
[0035]实施例2
[0036]1)发酵:将1.5g魔芋飞粉加入到lOOmL发酵培养基中，采用栖土曲霉和地衣芽孢杆菌进行共生发酵，发酵完成后，发酵液在4°C下经lOOOOr/min离心20min去除菌体，上清液加5倍纯化水，三氯乙酸调pH至4，静置后去沉淀，上清液即为魔芋糖肽液。
[0037]其中，培养基的组成为:蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN03 0.lg、K2HP04 0.15g、KC1
0.lg、MgS04.7H20 0.06g、FeS04 0.01g，蒸馏水100mL。培养基的pH值为9，栖土霉菌与地衣芽孢杆菌的菌种比例为1:2，菌液浓度稀释至1 X 10s个/mL，接种量为12 % (V/V)，发酵温度为38°C，发酵时间为24h。
[0038]2)超滤:将魔芋糖肽液依次通过截留分子量为100KD及10KD的超滤膜，收集分子量分布于10?100KD区段的超滤液。
[0039]3)采用规格为5cmX60cm的Sephadex G_75凝胶层析柱对超滤液进一步分离纯化。凝胶柱分离条件为:上样量10mL，样品浓度为100mg/mL，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为5mL/min。每管收集3mL。收集合并280nm和460nm吸收峰处的组分，浓缩后在-70°C、llOPa下真空冷冻干燥12h，即可得到纯化的甘露聚糖肽。
[0040]实施例3
[0041]1)发酵:将2.5g魔芋飞粉加入到lOOmL发酵培养基中，采用栖土曲霉和地衣芽孢杆菌进行共生发酵，发酵完成后，发酵液在4°C下经12000r/min离心lOmin去除菌体，上清液加4倍纯化水，三氯乙酸调pH至3.9，静置后去沉淀，上清液即为魔芋糖肽液。
[0042]其中，培养基的组成为:蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN03 0.4g、K2HP04 0.05g、KC1
0.02g、MgS04.7H20