一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种片球菌素生产方法，特别涉及乳酸片球菌与片球菌素同步生产的 方法。
【背景技术】
[0002] 在控制食品中病原性和腐败性微生物方面，一个重要的发展就是细菌素的发现。 细菌素为肽类物质，由细菌产生，在食品工业上，细菌素指的是由乳酸菌产生，对许多腐 败和病原细菌有杀灭作用。因为他们符合公认安全的标准（Generallyrecognizedas safe，GRAS)，因此，具有作为食品保藏剂的巨大潜力。乳酸菌产生的细菌素对食品工业有极 强的吸引力，还因为他们属于天然食品防腐剂，使用这些抗菌肽可以大大减少化学添加剂 的使用量或减少物理处理的强度。
[0003] 到目前为止，nisin(乳链球菌素）是唯一得到商业化和大规模应用的细菌素。尽 管nisin具有抗菌谱较广、天然、无毒副作用、安全、高效等优点，但其在在中性和碱性条件 下溶解度低，对食品中一些酶敏感，及一些细菌可对其产生抗性等问题。因此，对于仅单独 用一种细菌素贮藏的食品，抗细菌素的病原微生物的出现是潜在的威胁。克服这些问题的 途径之一是开发更多的细菌素，并将多种细菌素联合应用，以弥补使用单一细菌素可能出 现的问题。片球菌素被认为是继nisin之后第二个有望用于食品工业的细菌素。主要因为 它由符合GRAS标准的片球菌产生，具有广谱抑菌作用，在食品中性质稳定，进入消化道后 迅速被蛋白酶消化等特征。
[0004] 乳酸片球菌能够定居到动物和人的消化道，作为潜在的益生菌显示出良好的应用 前景。目前乳酸片球菌作为益生菌的应用主要集中在小动物、禽类、猪和水产动物等，正被 作为益生制剂用于治疗便秘、腹泻、消除应激反应、增强免疫力等。乳酸片球菌作为益生菌 制剂代替抗生素用于饲料中是国际上备受推崇的措施之一，具有良好的市场前景。
[0005] 现有的片球菌素纯化方法，都较为繁琐，大量纯化成本也较高。且在纯化的过程中 只提取片球菌素，而乳酸片球菌则在纯化的过程中死亡而未被收集利用。乳酸片球菌有很 多益生作用，在发酵过程中不能够收集应用是一种浪费。因此建立获得乳酸片球菌菌体和 片球菌素的同步生产工艺具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种乳酸片球菌与片球菌素同步生 产的方法，克服现有技术中片球菌素纯化方法繁琐、成本较高、乳酸片球菌在纯化的过程中 未被收集利用的问题。
[0007] 本发明的技术方案是：一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，包括以下步 骤：
[0008] (1)将含有乳酸片球菌和片球菌素的发酵液调节pH为2. 8-3. 2,搅拌进行解吸 附；
[0009] (2)将步骤（1)解吸附的发酵液离心处理，得到上清液和菌体；
[0010] (3)将步骤（2)所得上清液依次经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥工艺获得片球菌 素产品；
[0011] (4)将步骤（2)所得菌体进行喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂。
[0012] 所述步骤（1)搅拌解吸附速率为200r/min，时间2h。
[0013] 所述步骤⑵离心的条件为4°C，lOOOOrpm。
[0014] 所述步骤⑶微滤的条件为0.45 μ m水系微滤膜，室温，压力为0· IMpa。
[0015] 所述步骤（3)超滤工艺的条件为：选择截留分子量为5000Da的聚醚砜膜，在室温， 0. 02MPa的条件下进行超滤处理，超滤浓缩比为3时，进行洗滤操作，加入与初始料液等体 积的去离子水进行全过滤工艺，待超滤浓缩比为5时停止超滤处理。
[0016] 所述步骤（3)纳滤工艺的条件为：选择截留分子量为650Da的聚醚砜膜，在室温， 0. 02MPa的条件下进行纳滤处理，纳滤浓缩比为4时停止纳滤浓缩。
[0017] 所述步骤（3)冷冻干燥获得片球菌素产品工艺为：将纳滤浓缩液中加入一定量的 氯化钠，最终浓度为70% -80%，首先-45°C预冻2h，温度为-56°C，干燥6h。
[0018] 所述步骤⑷喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂工艺为：保护剂为海藻 糖 48-52g/L，β-环糊精 28-32g/L，乳糖 38-42g/L，脱脂乳粉 98-102g/L;进 口温度 145-155°C，进料流速为65-75mL/h，保护剂与菌泥的比例为0. 235-0. 245(L:g)。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明同步生产方法同时获得了乳酸片球菌菌体和片球 菌素产品。乳酸片球菌喷干制剂的活菌数可达到8. 5X1012-8. 6X1012CFU/g，存活率为 20-25%。片球菌素产品的纯化倍数为2. 5% -2. 6 %以上，收率可达到80% -85%。
【附图说明】
[0020] 图1乳酸片球菌素效价标准曲线；抑菌圈直径差：不同浓度的片球菌素溶液与中 心浓度（片球菌素溶液与PBS缓冲液1:1混合，效价为320AU/mL)的片球菌素溶液抑菌圈 直径的差值；
[0021] 图2乳酸片球菌菌体和片球菌素同步生产工艺流程图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做详细说明。
[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 海藻糖购自南宁中诺生物工程有限责任公司，谷氨酸钠购自国药集团化学试剂有 限公司、α-乳糖购自上海恒信化学试剂有限公司、β-环状糊精购自西安宏昌药业有限责 任公司、脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司。
[0026] 5000Da和650Da聚醚砜超滤滤膜，美国Pal1公司；小型喷雾干燥机，美国 Labplant公司。
[0027] 本发明中所述乳酸片球菌是指乳酸片球菌PA003 (Pediococcus acidilactici PA003)〇
[0028] 实施例1
[0029] 片球菌素效价测定
[0030] 乳酸片球菌发酵液用2mol/L的HCI调节pH到1. 9-2. 0,防止乳酸片球菌素吸附 到细胞上，65-70°C水浴28-30min，防止发酵液中的蛋白酶破坏细菌素。然后，8000r/min， 4°(：离心15-2〇11^11，取上清液用2111〇1/1的似0!1调节？!1到5.9-6.1，进行抑菌试验测定乳酸 片球菌素效价。乳酸片球菌素的抑菌活性实验参考管碟法。效价的测定采用二倍稀释法， 以李氏杆菌为指示菌，细菌素液依次用0. 02mol/L，pH6. 0的磷酸缓冲液（PBS)2倍稀释，用 对指示菌显示抑菌圈的最高稀释倍数表示细菌素活性，计算式为：AU/mL= 2nX(1000/x)，n 表示对指示菌显示抑菌圈的大小与牛津杯外径的差值不小于2mm的孔数；x表示每孔中的 细菌素液加样体积。二倍稀释法确定了乳酸片球菌培养16-17h后发酵液中乳酸片球菌素 的效价为640AU/mL，抑菌圈直径差与效价对数值呈线性关系，可绘出效价标准曲线（见图 1)〇
[0031] 实施例2
[0032] 发酵后乳酸片球菌上吸附的片球菌素含量分析
[0033] 乳酸片球菌培养16h后，发酵液分别进行如下处理：（1)发酵液离心（8000r/min， 4°C，lOmin)，上清液用4mol/LHCI调pH为2. 0,置于4°C冰箱备用，收集菌体备用；（2)上 述离心后的菌体2次洗涤后，加入发酵液等体积的100mm〇l/LNaCl(pH2. 0)，电动搅拌12h， 取上清液备用；（3)发酵液不离心直接用4mol/LHCI调pH为2. 0,电动搅拌搅拌12h，取上 清液备用；（4)发酵液用 4mol/LHCI调pH为 2. 0, 70°C，30min灭酶，离心（8000r/min，4°C， lOmin)取上清液，置于4°C冰箱中保存备用。
[0034] 发酵结束后菌体细胞上吸附的片球菌素含量为总片球菌素含量的28. 51%。需要 对乳酸片球菌进行解析附处理以增加发酵液中的片球菌素含量。为了同步获得较多产量的 乳酸片球菌素及活菌体，选择2h作为其适宜的解吸附时间，pH值3. 0作为片球菌素的适宜 吸附pH值。
[0035] 实施例3
[0036] 超滤膜的选择
[0037] 根据处理料液的性质及目的的不同，需选取合适的超滤膜进行超滤操作，实验通 过测定片球菌素纯化倍数和回收率、膜通量、杂蛋白去除率和膜抗污染性能指标来筛选最 适合的超滤膜。实验选择截留分子量分别为l〇〇〇Da，5000Da，lOOOODa的聚醚