EQ ID NO: 25)或嵌合AtMAl的转基因系显示出完全和可比较的三价铁还原活性(在植物中铁 摄取之前首要必备的步骤），其中嵌合AtIMAl具有在非保守氨基酸部分编码删除（例如， 35Spro::頂AloRFΔl(SEQIDNO:137)以及35Spro::IMAloRFΔ2(SEQIDNO:138)) ;然而，与 此相反，在由具有C末端基序删除的嵌合AtIMAl转化的转基因系(例如，35Spro::頂AIorf Δ 3 (SEQ ID NO: 139))中，三价铁还原活性几乎消失。图2E。
[0078] 本发明可以应用的植物包括单子叶植物和双子叶植物两者。单子叶植物的实例包 括但不限于:水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、竹子、甘蔗、洋葱、韭菜和生姜。在双子叶植 物的实例包括但不限于拟南芥、茄子、烟草植物、红辣椒、西红柿、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗、菠 菜、甜菜、甘薯、序菜、胡萝卜、水序、欧序、大白菜、卷心、菜、萝卜、西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、 草莓、大豆、绿豆、芸豆和豌豆。优选地，本发明的转基因植物是可食用的。
[0079] 还提供本发明转基因植物的植物组织、植物部分或植物细胞。具体地说，本发明的 转基因植物的植物组织、植物部分或植物细胞包括，例如，叶、根、果实或种子，其中微量元 素(铁、锌、锰)的含量与来自对照植物中的相比是提高的。优选地，所述植物组织、植物部分 或植物细胞是可食用的。
[0080] 因此，本发明还提供了用于生物强化的方法，包括在表达铁调节多肽、足以在转基 因植物中增加微量元素的含量的条件下使本发明的转基因植物或其种子或其它繁殖材料 生长，其中所述微量元素选自铁(Fe)、锌(Zn)和锰(Μη)。然后选择和收获其中微量元素(铁， 锌，锰)的含量与对照植物相比得到提高的这种转基因植物或其植物部分或组织(优选可食 用部分）。
[0081] 特别地，本发明提供用于生产具有增加的微量元素含量的转基因植物的方法，其 包括(a)用含有编码本文所述铁调节多肽的核苷酸序列的重组多核苷酸转化植物细胞，以 获得重组植物细胞；以及(b)使在(a)中获得的重组植物细胞生长以生产转基因植物。为选 择具有所需性状的植物，本发明的方法还包括( c)选择与生长在同样条件下的野生型植物 (非转基因）相比以更高水平积累微量元素(铁、锌、锰)的转基因系。
[0082] 在一些实施方案中，根据本发明的转基因植物或其部分是可食用的，因此可以直 接作为食物食用，用于在受试者中补充微量元素。
[0083] 在一些实施方案中，根据本发明的转基因植物或其部分被进一步处理，例如被干 燥、研磨或冷冻干燥以形成植物产品，然后所述产品可配制成组合物，其可以例如用作营养 补充剂/制剂或用于治疗微量元素缺乏的药物组合物。因此，本发明还提供一种在受试者中 补充微量元素的方法，包括施用有效量的如本文所述的转基因植物、由其所制得的植物产 品或包括此植物产品的组合物。本发明的方法可用于治疗微量元素缺乏，如铁、锌或锰的缺 乏或其组合。例如，铁缺乏可引起贫血。本发明还提供转基因植物用于制备植物产品或包括 该植物产品的组合物的用途，可用于在有需求的受试者补充微量元素或治疗微量元素缺 乏。具体地，本发明的组合物，包含从根据本发明的转基因植物或其部分制成的产品，与可 接受的载体一起配制以促进递送。"可接受的"是指该载体与组合物中的活性成分相容，且 优选能稳定所述活性成分和对接受治疗的个体是安全的。所述载体可以是对活性成分的稀 释剂、运载体、赋形剂、或基质。合适的赋形剂的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、 甘露糖、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、树胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷 酮、纤维素、无菌水、糖浆、和甲基纤维素。所述组合物可另外包含润滑剂，例如滑石，硬脂酸 镁和矿物油;湿润剂;乳化剂和悬浮剂;防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和丙酯;甜味剂;和调味 剂。本发明的组合物在施用至患者后可以提供活性成分的快速、持续或延迟释放的效果。
[0084] 本发明的组合物可以使用常规技术根据所需配制成任何形式。在特定实例中，本 发明的组合物是粉末，更具体地是冻干粉末的形式，其可以进一步加载到胶囊中。在其它实 例中、本发明的组合物是片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、囊剂、扁囊(cachet)剂、酏剂、悬浮剂、乳 剂、溶液、糖浆剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、或无菌注射溶液的形式。所述组合物可以通过任 何医学上可接受的途径给药，如口服、肠胃外（例如肌内、静脉内，皮下、腹腔内）、局部、透 皮、吸入等等。
[0085] 本文所用的术语"有效量"是指赋予受治受试者以治疗效果的活性成分的量。例 如，用于补充微量元素有效量的是可在有此需要的受试者中，例如在营养不良的情况下提 供所需微量元素含量的量。
[0086]本发明通过下面的实施例进一步阐明，所述实施例用于说明而非限制。鉴于本公 开，本领域的技术人员应当理解，在公开的具体实施例中可进行许多变化并仍能获得相似 或类似结果而不脱离本发明的精神和范围。
[0087] 实施例
[0088] 缺铁乏严重影响植物的性能和营养品质，是在人类贫血最常见的原因。来自铁缺 陷水稻和拟南芥植物的转录组数据的共表达和序列基序分析，鉴定了一个新的肽家族，其 共享一个短C-末端氨基酸序列基序，该基序在被子植物中的众多高度多样化的肽中是保守 的。我们命名其为肽序列IRON .N(IMA)，指其通过激活铁吸收基因引发铁和锰积累的能 力。重组MA肽的C-末端?序的删除完全消除了该功能。頂A直系同源基因对不同物种的铁 状况是高响应的，这不依赖获取铁的策略。IMA在植物中缺缺乏信号传导中是至关重要的， 其控制摄取、转运和铁的细胞稳态级联的早期发挥作用。操纵IMA肽的表达代表了一种新的 用于作物中铁生物强化的策略。
[0089] 1.材料和方法
[0090] 1.1构建水稻基因共表达网络
[0091] 为鉴定水稻和拟南芥之间保守的功能未知的铁响应序列基序，使用BLASTN程序(e 值〈9.9e_6)针对来自水稻Pseudomolecules和基因组注释数据库的V7发布的转录物对 Affymetrix基因芯片水稻基因组微阵列探针的寡核苷酸序列进行图位，并且使用来自 ArrayExpress(www. ebi .ac .uk/arrayexpress/)检索的2700可公开获得的微阵列杂交的数 据库来构建铁-响应水稻基因的共表达网络。1349个探针用作输入来计算具有Pearson相关 系数截止(cut off)P>0.6的共表达网络，使用MAC⑶软件用于基因表达的匹配相关性(24)， 所述探针在由Zheng等人（15)所进行的微阵列实验中在响应铁缺乏时显示>5倍的信号变 化。为了将网络限制到与铁稳态密切相关的处理，在（1)中列出的铁响应基因和它们的水稻 直系同源基因，以及在此网络中存在的来自ZIP、YSL和NRAMP家族的所有转运子被选择产生 新的网络，其由这些基因和最相邻的邻居所组成。使用InParanoid软件将拟南芥直系同源 基因分配至水稻基因座。如果没发现直系同源基因，最接近的拟南芥序列目录(Sequelog) 被分配到水稻基因。在模糊分配的情况下，我们使用保守的方法并将单个水稻基因座匹配 至几个拟南芥基因。
[0092] 1.2氨基酸序列基序分析
[0093]从各种数据库中检索具有未知功能的候选蛋白序列。这些序列与来自Rodriguez-Celma等人（16)发布的基因网络中的未知功能的拟南芥蛋白一起被用作输入用于MEME组件 4.9.1在线工具（24)。使用用于基序选择工具(Motif Elicitation tool)的多重Em进行基 序发现，然后发现的基序在输入序列中使用Motif比对和搜索工具(MAST)进行搜索。頂A基 序是源自这次分析的唯一显着基序。我们鉴定了一些基因，其编码在铁缺陷型西红柿（19)、 水稻（15)和大豆(20)的转录物中在C末端位置含有相似基序的肽，并且使用所有这些序列 来细化这些基序的共有序列。
[0094] 1.3序列比对
[0095]我们找到在C末端位置具有MA基序的蛋白的约130个独立序列，其来自Uniprot、 NCBI、独立基因组注释工程网站以及EST数据库。使用CLC序列可视软件进行比对。手工调整 比对以用于产生邻接树。
[0096] 1.4基因表达分析
[0097]拟南芥(Arabidopsis thaliana(L. )Heynh.，C〇1_0)植物在前述(25)的介质中生 长在生长皿中。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA，并且使用Superscript III反转录酶 (Life Technologies)合成cDNA〇在ABI Prism 7500Sequence Detection System(Applied Biosystems)中进行实时RT-PCR。如前述（22)进行并分析全部定量RT-PCR运行。用于qRT-PCR的引物列在表1中。
[0098] 表1.用于qRT-PCR的寡核苷酸
[0099]
[0101] 1.5生成转基因系
[0102] 使用工程化的BamHI位点来扩增全长AtIMAlcDNA，并克隆至BamHI消化的和去磷酸 化的？811?訓(2中以生成?1?01(1獻1双元载体，其用于拟南芥（系355口仰：：頂六1〇0嫩0-8、1- 4、2-1和3-4)以及西红柿转化（系353?仰：：1]\^1〇0财厶-1和厶-3)。用于过表达厶《]\^1(系 35Spro::頂A1qrf#7和#8)的构建体，IMA1 Δ 1、頂Α1 Δ 2、IMA1 Δ 3和IMA3，两个基因的 153bp和 144bp阅读框在5 '使用工程化的Xbal位点以及在3 '使用SacI位点被克隆至PCR8/GW/T0P0 中，然后获得质粒ρΜΑΙΤΟΡΟ和pIMA3T0P0，其随后通过Gateway?重组转移至pH2GW7载体 (26)中，产生pMMAl和pMMA3载体。通过使用ρΠΙΑΙΤΟΡΟ作为模板的PCR来产生頂A1删除。使 用M13正向引物和磷酸化的互补于删除位点相邻序列的反向引物来扩增在删除位点5 '的片 段。使用与删除位点相邻序列互补的正向磷酸化引物和M13反向引物来扩增在删除位点3' 的片段。分别使用Xbal或SacI来消化这两个扩增子，并且将其一起连接至p頂A1T0P0载体， 所述载体中頂A1全长⑶S已经通过Xbal-SacI酶切消化来移除。通过这种方法来获得p頂Α Δ 1Τ0Ρ0、ρΙΜΑΔ 2T0P0和ρΜΑΔ 3T0P0质粒，并且将其与pH2GW7重组以产生双元ρΗΙΜΑΙ Δ 1、 ρΗΜΑΙ Δ 2和ρΗΜΑΙ Δ 3。根据Schwab等人（27)使用在线网络microRNA设计工具产生靶向 IMA1和IMA2两者的人工microRNA。通过定点诱变工程化miR319a骨架来产生pHamiR-頂A1载 体，以靶向两个基因共有的TTACTAATAGGAGACAATCAT序列（SEQ ID NO: 185)。嵌合amiR-頂A1 基因克隆至pENTR?/D/T0P0载体中，随后使用gateway系统插入至pH2GW7中。根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 (pMP90)用于通过花