制备抗人乳头瘤病毒抗原的t细胞的方法
【专利说明】制备抗人乳头瘤病毒抗原的τ细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求于2013年7月15日提交的美国临时专利申请第61 /846，161号的权 益，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] -些癌症类型，例如宫颈癌的主要原因是人乳头瘤病毒(HPV)感染。尽管在诸如化 疗的治疗中取得进展，但包括HPV相关癌症在内的许多癌症的预后可能很差。因此，存在对 癌症，特别是HPV相关癌症的其他治疗的未得到满足的需求。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明的实施方案提供了制备HPV特异性Τ细胞群的方法，所述方法包括:将HPV阳 性肿瘤样品分成多个碎块;在仅存在一种细胞因子的情况下分别培养多个碎块;从培养的 多个碎块中获得τ细胞;检测用于特异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或 两种的Τ细胞;选择显示出特异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或两种的Τ 细胞;以及扩增所选择的Τ细胞数目以产生HPV特异性Τ细胞群。
[0007] 本发明的另一个实施方案提供了制备HPV特异性Τ细胞群的方法，该方法包括:将 HPV阳性肿瘤样品分成多个碎块;分别培养多个碎块;从培养的多个碎块中获得Τ细胞;检测 用于特异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或两种的Τ细胞;选择显示出特 异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或两种的Τ细胞；以及采用（i )0ΚΤ3抗体 和(ii)白细胞介素（IL)_2中的一种或两种扩增所选择的Τ细胞数目以产生HPV特异性Τ细胞 群。
[0008] 本发明的又一实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，该方法包 括:将HPV阳性肿瘤样品分成多个碎块;分别培养多个碎块;从培养的多个碎块中获得T细 胞;检测用于特异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或两种的T细胞;选择显 示出特异性自体HPV阳性肿瘤识别和HPV抗原识别中的一种或两种的T细胞;扩增所选择的T 细胞数目以产生用于过继性细胞疗法的HPV特异性T细胞群；以及以有效治疗或预防哺乳动 物中的癌症的量向哺乳动物施用扩增数目的T细胞。
[0009] 附图简述
[0010] 图1A是显示在与靶标gplOO肽库(有阴影的柱)或HPV 18E7肽库(无阴影的柱)共培 养后，由1号患者的22个肿瘤碎块(F1-F22)产生的效应肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或黑色素 瘤TIL分泌的干扰素 -γ (IFN-γ )(pg/mL)的图。
[0011] 图1B是显示在与靶自体肿瘤细胞系（无阴影的柱）或624细胞（黑色素瘤细胞系） (有阴影的柱)共培养后，效应黑色素瘤TIL或由1号患者的22个肿瘤碎块(F1-F22)产生的 TIL分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。
[0012] 图2A是显示在与靶自体肿瘤细胞（有阴影的柱）、自体组织的外周血单核细胞 (PBMC)(有正斜线阴影的柱），与所有I类基因座匹配的肿瘤细胞(有反斜线阴影的柱），HLA 不匹配的HeLa细胞(有纵条纹的柱)或HLA不匹配的CaSki细胞(有横条纹的柱)共培养后，由 1号患者的F16、F17或F22肿瘤碎块产生的效应TIL，或给予患者用于治疗的细胞（"输液袋"） 分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。
[0013] 图2B是显示在单独培养(无肿瘤)或与用针对HLA-A、HLA-B、HLA-C的沉默RNA或针 对不相关靶标的RNA(非靶向）的自体肿瘤细胞共培养后，由1号患者的效应TIL分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。
[0014]图2C是显示在无抗体(黑色柱）、有抗HLA-A2抗体(有反斜线阴影的柱)或抗II类抗 体(有正斜线阴影的柱）的情况下，在与靶细胞（效应/靶细胞：1号患者的TIL/自体肿瘤细 胞;DMF5/624细胞;或F15/HPV18E6m-135)共培养后，由效应TIL分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。 白色柱表示单独培养的效应细胞。
[0015]图3是显示在与gplOO肽库（白色柱）、0KT3抗体(有横条纹的柱)或用HPV 18E7肽库 (黑色柱）、HPV 18Ε7肽库和W6/32(有细的正斜线阴影的柱）、HPV 16Ε7η-19(有粗的正斜线阴 影的柱）、HPV 16Ε7η-19和16/32(有方格的柱）、HPV 16Ε7η-19和冊145(有垂直交叉的柱）、 HPV 18E6m -135(有反斜线阴影的柱）、HPV 18E6m -135和W6/32(有交叉的柱）或HPV 18E6m-135和HB 145(有白色勾勒黑色长方形的柱)脉冲刺激的树突细胞(DC)共培养后，由1 号患者的F16或F22肿瘤碎块的效应TIL;给予患者用于治疗的细胞（"输液袋"）；黑色素瘤 TIL1、2或3(从黑色素瘤肿瘤培养的TIL);mE7TCR(经转导以表达针对HPV 16E7n-的T 细胞）；或F15TIL(来自另一名患者的TIL，其对HPV 18E6m-135具有反应性，为II类限制性 的，因此可以用HB145封闭）分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。
[0016] 图4A和4B是显示在与gplOO肽库(灰色柱)或HPV 18E7肽库（黑色柱)共培养后，由1 号患者的F16肿瘤碎块克隆的效应TIL的1 -24号克隆(A)或24-48号克隆（B)分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。
[0017] 图5是显示在与用HPV 18E6肽库（黑色柱）、HPV 18E7肽库（灰色柱）或gplOO肽库 (对照)脉冲刺激的树突细胞共培养后，由12号患者的36个不同的肿瘤碎块(F1-F36)或黑色 素瘤TIL(DM5)(对照)分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。
[0018] 图6是显示在与用编码绿色荧光蛋白（GFP)(白色柱)或HPV 18E6(灰色柱）的慢病 毒载体转导的DC或用gplOO肽库(有正斜线阴影的柱)或HPV 18E6肽库(有反斜线阴影的柱） 脉冲刺激的DC共培养后，由12号患者的F1肿瘤碎块或黑色素瘤TIL1、2或3产生的效应TIL分 泌的IFN- γ (pg/mL)的图。有横条纹的柱表示与0KT3抗体培养的TIL。
[0019] 图7A是显示在单独培养(灰色柱)或与HPV18E6肽库（黑色柱)共培养后，1、3、12和 20号克隆分泌的肿瘤坏死因子(TNF)a( Pg/mL)的图。
[0020] 图7B是显示在单独培养（白色柱）或与HPV18E6肽库（灰色柱）或HPV18E6肽子库1 (有正斜线阴影的柱）、子库2(有反斜线阴影的柱）、子库3(有横条纹的柱）、子库4(有纵条纹 的柱)或子库5(黑色柱)共培养后，3、12和20号克隆分泌的TNFa(pg/mL)的图。
[0021 ]图7C是显示在单独培养（白色柱)或与HPV18E6的30号肽(有点状的柱）、31号肽（黑 色柱）、32号肽(灰色柱）、33号肽(有纵条纹的柱）、34号肽(有正斜线阴影的柱）、35号肽(有 反斜线阴影的柱）、36号肽(有方型的柱)或37号肽(有交叉缝式的柱)共培养后，3、12和20号 克隆分泌的TNFa(pg/mL)的图。
[0022] 图8六-8(：是显示在与自体?81(：(?12)或来自供体1-6之一的?8如共培养后，3以）、12 (B)和20号(C)克隆分泌的TNFa(pg/mL)的图。
[0023]图9A是显示在与用HPV 18E677-9i(无阴影的柱）或HPV 18E6m-135肽(有阴影的柱） 脉冲刺激的自体 PBMC(P12)或 DRB1*15、DQB1*06 供体 PBMC、DRB1*15 供体 PBMC 或 DQB1*06 供体 PBMC共培养后，12号患者的F15肿瘤碎块的3号克隆分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。
[0024] 图9B是显示在具有针对HLA-DR(有横条纹的柱）、HLA-DQ(有反斜线阴影的柱）、 HLA-DP(有正斜线阴影的柱)的抗体、泛I类抗体(黑色柱)或泛II类抗体（白色柱）的情况下， 在与用HPV 18E6m-135肽冲刺激的PBMC或与624细胞共培养的mF5T细胞(经转导以表达抗 MART-1的TCR)共培养后，12号患者的F15肿瘤碎块的20号克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。
[0025] 图10是显示在与用HPV 16E6肽库(有反斜线阴影的柱）、HPV 16E7肽库(有正斜线 阴影的柱）或gpl〇〇肽库（对照）（黑色条)脉冲刺激的树突细胞共培养后，来自4号患者的24 个不同的肿瘤碎块(F1-F24)的效应TIL或黑色素瘤TIL(对照）分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。 星号(*)表示τ IL输注入患者。
[0026]图11A是显示在与用HPV 16E7肽库(有阴影的柱)或不用肽(无阴影的柱)脉冲刺激 的树突细胞共培养后，来自4号患者的CD8阳性效应TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。 [0027]图11B是显示在与用HPV 16E7肽库(有阴影的柱)或不用肽(无阴影的柱)脉冲刺激 的树突细胞共培养后，来自4号患者的CD4阳性效应TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。 [0028]图11C是显示在与用HPV 16E6肽库(有阴影的柱)或不用肽(无阴影的柱)脉冲刺激 的树突细胞共培养后，来自4号患者的CD8阳性效应TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。 [0029]图11D是显示在与用HPV 16E6肽库(有阴影的柱)或不用肽(无阴影的柱)脉冲刺激 的树突细胞共培养后，来自4号患者的CD4阳性效应TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的图。
[0030] 图12A-B是用过继性细胞疗法治疗前(A)和治疗后九个月（B)的4号患者胸部的计 算机断层扫描(CT)。A中的箭头指向腹主动脉旁淋巴结中的癌性病灶。
[0031] 图12C-D是用过继性细胞疗法治疗前（C)和治疗后九个月（D)的4号患者胸部的CT 扫描。C中的箭头指向左肺门淋巴结中的癌性病灶。
[0032] 图12E-F是用过继性细胞疗法治疗前(E)和治疗后九个月（F)的4号患者骨盆的CT 扫描。E中的箭头指向髂总淋巴结中的癌性病灶。
[0033]图13是显示在与用HPV 18E6肽库(有反斜线阴影的柱）、HPV 18E7肽库(有正斜线 阴影的柱）或gpl〇〇肽库（对照）（黑色柱)脉冲刺激的树突细胞共培养后，来自8号患者的24 个不同的肿瘤碎块的效应ΤIL或黑色素瘤ΤIL (对照)分泌的IFN- γ (pg/mL)的图。星号(*)表 示TIL输注入患者。
[0034]图14A-B是用过继性细胞疗法治疗前(A)和治疗后两个月（B)的8号患者肝脏的磁 共振成像(MRI)扫描。A中的箭头指向癌性肝部肿块。
[0035]图14C-D是用过继性细胞疗法治疗前（C)和治疗后两个月（D)的8号患者腹部的CT 扫描。C中的箭头指向腹膜后淋巴结中的癌性病灶。
[0036] 图14E-F是用过继性细胞疗法治疗前(E)和治疗后两个月（F)的8号患者腹部的CT 扫描。E中的箭头指向癌性腹壁肿块。
[0037] 图14G-H是用过继性细胞疗法治疗前(G)和治疗后两个月（H)的8号患者骨盆的CT 扫描。G中的箭头指向癌性左结肠周肿块。
[0038]图15A是显示在HPV-TIL输注后各时间点（月数）的4号患者的腹主动脉旁（圆形）、 左门（正方形）、右门（Δ)和髂总（▽)的肿瘤尺寸测量值(从基线的变化％)的图。
[0039]图15B是显示在HPV-TIL输注后各时间点（月数）的8号患者的腹壁（圆形）、腹主动 脉旁(正方形）、左骨盆（A )和右输尿管(▽)的肿瘤尺寸测量值(从基线的变化％)的图。
[0040] 图16A-D是8号患者延迟钆增强的T1加权MRI图像。A和C各自显示治疗前肝表面的 肿瘤。B和D显示治疗后11个月均无肿瘤。A和C中的箭头指示肿瘤的位置。
[0041] 图17A是治疗后各时间点（天数）测量的4号患者血清细胞因子水平(pg/ml)的图。 测量的细胞因子包括白细胞介素（IL)_2(实心圆）、IL-4(正方形）JL-6(A) JL-13(T)、粒 细胞集落刺激因子(G-CSF)(菱形）和肿瘤坏死因子a(TNF-a)(空心圆）。施用于患者的细胞 因子标有下划线。
[0042] 图17B是治疗后各天测量的8号患者的血清细胞因子水平(pg/ml)的图。测量的细 胞因子包括IL-2(实心圆）、IL-5(实心正方形）、11^6(赢）、11^8(^)、6-05?(菱形）、单核细 胞趋化蛋白-1 (MCP)-1 (空心圆）和TNF-a(空心正方形）。施用于患者的细胞因子标有下划 线。
[0043] 图18A-D是显示待施用于4号患者(A和C)或8号患者(B和D)的TIL针对HPV E6(有阴 影的柱）、HPV E7(有阴影的柱）或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)(对照）的反应性的图，如通过 IFN- γ的分泌(pg/ml) (A和B)和ELI SPOT分析(C和D)测定。无阴影的柱代表来自同一名患者 的EBV反应性的T细胞的反应性(对照）。
[0044]图19A-B是显示在输注TIL后不同时间点（天数）时的4号