一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法，属于生物技术 领域。 技术背景
[0002] 白藜芦醇(Resveratrol，简称Res)，是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。花生具有白藜芦醇的合成能力，花生 中白藜芦醇主要分布于花生的根组织。然而，花生的根和根瘤菌存在着互利共生的关系，花 生成熟之后的根往往会附着大量根瘤，不利于白藜芦醇的提取纯化。花生生理成熟的后期， 经常遇到干旱，导致花生的根和果实受到黄曲霉的污染，因此，这类花生根不能用于白藜芦 醇的提取。此外，花生自然根中白藜芦醇的含量相比虎杖和葡萄皮都比较低，提取纯化效率 极低，成本增加。
[0003] 在花生各组织中，白藜芦醇以根中的含量最高。因此，快速获得大量根，既获得了 植源性的白藜芦醇材料，进而可以大量提取白藜芦醇。而发根农杆菌可以侵染植物，在伤口 处形成发状根，且发状根无激素依赖性，又可以快速生长，在短时间内增长数百倍甚至上千 倍。基于此，以发状根液体培养是快速大量生产白藜芦醇的一条捷径。刘杰等研究表明：花 生发状根的最适基本液体培养基为无激素的MS培养基，添加植物激素会不同程度的抑制发 状根的生长，100ymol/L水杨酸(SA)可以提高花生发状根白藜芦醇苷合成分泌以及白藜 芦醇的合成。Fabricio等研究发现，花生发状根可以高效产生白藜芦醇，不同生长阶段的发 状根诱导产生白藜芦醇含量不同，且在合适的生长阶段，一定浓度的醋酸钠诱导发状根24 h，白藜芦醇会被分泌到液体培养基中。以上研究都是用发根农杆菌直接侵染花生产生发状 根而进行的研究;对用根特异启动子驱动花生白藜芦醇基因在花生发状根中的大量表达， 进而优化研究发状根的白藜芦醇产量的研究未见报道。况且，发状根的生长受很多因素的 影响，培养基、培养温度以及机械压力都会影响发状根的生长。已知，发状根的次生代谢产 物含量都很低，需要在筛选高含量白藜芦醇发状根系的基础上，优化发状根的液体培养条 件，提高发状根的生长速度，通过诱导物的诱导，使白藜芦醇含量大幅提高，为工业大规模 利用花生发状根液体悬浮培养大量生产白藜芦醇奠定理论基础。
[0004] 本发明针对以上研究背景，利用已经获得的转基因花生发状根新材料，经醋酸钠 诱导增加花生发状根中白藜芦醇含量，通过发状根液体悬浮培养，快速大量获得发状根。利 用有机溶剂浸提法和萃取法分别提取发状根和培养基中的白藜芦醇并进行HPLC检测，本发 明可为利用生物反应器规模化培养花生发状根生产白藜芦醇奠定良好的基础。
【发明内容】
[0005] 本发明利用烟草根特异表达启动子驱动花生白藜芦醇基因，构建了PBI121-NtRl2-AhRESS根特异表达载体，采用多次冻融法把载体导入发根农杆菌，通过农杆菌介导， 把融合基因NtRl2:AhRESS整合到花生基因组，获得了同时表达发状根基因和AhRESS基因的 花生发状根生产系，，在发状根培养的中后期通过加入醋酸钠诱导大大增加花生发状根中 白藜芦醇的合成量，通过减少培养基的浓度和数量，提高了悬浮培养条件快速大量获得发 状根。利用有机溶剂浸提法和萃取法分别提取发状根和培养基中的白藜芦醇并进行HPLC检 测。本发明可为利用生物反应器规模化培养花生发状根生产白藜芦醇奠定良好的基础。
[0006] 本发明提供了一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法。目的在 于建立一种诱导转基因花生发状根生物反应器，并利用该反应器大量生产白藜芦醇的技 术。以便利用生物反应器规模化培养花生发状根进而大量生产白藜芦醇。
[0007] 技术方案 一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法，包括以下步骤： (1) 克隆烟草根特异启动子NtR12和花生AhRESS基因； (2) 烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR12-AhRESS的构建； (3)pBI121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生； (4) 转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养； (5) 醋酸钠诱导花生发状根使其白藜芦醇含量增加； (6) 花生发状根白藜芦醇的提取及检测； (7 )液体培养基中白藜芦醇的提取及检测。
[0008] 具体包括以下步骤： 1.烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR12-AhRESS的构建。
[0009] (1)克隆烟草根特异启动子NtR12,并连接至PMD18-T载体中，得到pMD18-NtR12载 体； (2)pBI121-NtR12-GUSA载体构建:将pBI121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因， 从pCAMBIA-1301载体中克隆⑶SA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA;将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR12载体进行酶切反应，将NtR12启动 子连接至pB1121-GUSA载体中，得到pB1121-NtRl2-GUSA载体； (3)pBI121-NtR12-AhRESS载体的构建:克隆花生白藜芦醇合酶基因AhRESS基因，并连 接到pB1121-NtRl2-GUSA载体中，得到pB1121 -NtR2-AhRESS载体。
[0010] 2.烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生。
[0011]在发根农杆菌诱导植物产生发状根的基础上，利用pBI121-NtR12-AhRESS载体转 化发根农杆菌，通过其介导遗传转化花生，获得转基因花生发状根。以CTAB法提取转基因花 生及对照的发状根的DNA，分别以AhRESS基因（AhRESS-F: 5 'ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和 AhRESS-R: 5 'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC3'）和rolB基因（rolB_F:5' GTCCTTGCAGTGCTAGATTT3 ' 和rolB-R: 5 'GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3 '）的上、下游引物进行 PCR;以CTAB法提取转基因花生及对照的发状根的RNA，按照PrimeScript逆转录酶说明书逆 转录后，以AhRESS基因特异引物(AhRESS-F: 5'ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和AhRESS-R: 5' TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC3'）进行RT-PCR，PCR反应条件为:94°C5min-(94°C30s- 57°C30s-72°C1.5min)35cycles-72°C10min-4°C保存。。筛选阳性发状根进行下 一步实验。
[0012] 3.转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养。
[0013]用1/2MS培养基，培养体系为：100mL1/2MS液体培养基，接种2-3根;培养条件为 28°C，以120rpm的震荡摇床中黑暗培养14d，发状根产量是接种量的100倍以上。筛选所得的 能够快速生长的转基因花生发状根液体培养后，收获发状根。
[0014] 4.醋酸钠诱导花生发状根使其白藜芦醇含量增加。
[0015] 醋酸钠诱导的时间为花生发状根培养至第11天时，加入醋酸钠溶液，醋酸钠的浓 度为20mM，诱导时间为24h。
[0016] 醋酸钠诱导能够提高花生发状根液体培养体系白藜芦醇产量，具体是醋酸钠从0-30mM增加过程中，花生发状根中白藜芦醇含量先增加后降低，醋酸钠为20mM时，其含量最 高为148.62yg/g，约为未诱导的2倍;醋酸钠从0-30mM增加过程中，培养基中白藜芦醇含 量先增加后降低，醋酸钠为20mM时，其含量最高为40.43yg/50mL，约为发状根中含量的 11.7%。以20mM的醋酸钠诱导处理花生发状根使白藜芦醇含量最大限度的增加，同时，处理 后的