转录因子gata3调控鸡肠道内糖转运蛋白sglt1和glut5表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及转录因子GATA3调控鸡肠 道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表达的方法。
【背景技术】
[0002] 单糖是动物生长发育不可或缺的营养物质。主要由糖异生途径产生，肠道也吸收 一部分外源的单糖。饮食中可溶性的碳水化合物在肠道中经消化最终分解成为葡萄糖、果 糖和半乳糖等单糖。糖类作为机体内的主要能源物质，在机体的代谢和内环境稳态等方面 都有着至关重要的影响。因此，研究肠道糖类吸收机制对动物的营养与健康都具有重要意 义，是国内外研究的热点。动物细胞膜的糖转运载体主要分为两大家族，一类为钠离子依赖 性单糖转运载体（SodiumDependentGlucoseTransporter,SGLTs)，其在单糖的转运过 程中要消耗能量；另一类为易化性单糖转运载体(FacilitatedGlucoseTransporter， GLUTs)，其转运单糖的过程不消耗能量。它们是肠道吸收糖类的重要载体。
[0003]钠离子依赖性单糖转运载体蛋白SGLT1对肠上皮细胞中营养、液体和电解质的转 运起重要作用。不同物种的SGLT1具有较高的同源性，大小为662-665个氨基酸。Gal-Garber 研究发现鸡SGLT1的氨基酸序列与人、绵羊和鼠等具有高度的同源性，84%-88%氨基酸残基 相同。而Turk等则发现SGLT1的二级结构是由14个跨膜的α螺旋组成，主要为MS1-MS14。更有 研究发现其羧基端对辨认葡萄糖起关键作用。在动物和细菌细胞中发现200多个SGLT家族 成员，在组织中从上皮细胞到中枢神经系统有11个人类基因表达。SGLT1是一种糖基化蛋 白，具有高度亲和力，主要在小肠黏膜表达，它是SGLT家族中是最基础的基因，也是研究最 多最彻底的基因。转运载体SGLT1是以细胞内外Na+浓度差为驱动力，然后在肠道逆浓度梯 度吸收葡萄糖。有研究表明这种转运机制是主要通过刷状缘膜进行转运葡萄糖和半乳糖 的，该转运蛋白还可以转运碘、氨基酸、泛酸等底物。Dyer等研究发现小肠黏膜上皮中SGLT1 表达量与小肠对单糖的吸收能力呈正相关。据报道70%小肠切除后，剩余小肠中SGLTlmRNA 的表达量与正常小肠相比增长三倍以上。现已证实，大多数物种中，饮食含有的碳水化合物 能调控肠道SGLT1的水平和活性。
[0004]GLUT5是易化性单糖转运载体家族的成员，是主要的糖转运蛋白。GLUT5在肾脏和 小肠中都显著表达，广泛分布于肠上皮细胞刷状缘和基底膜，作用主要为参与肠道果糖的 转运。转运机制主要是以易化扩散的方式顺果糖浓度梯度从细胞外将果糖转运到细胞内， 在转运糖类的过程中不需要消耗能量。GLUT5是低亲和力高容量的转运蛋白，对果糖的吸收 具有特异性和必要性。据报道GLUT5在小肠上皮细胞中的表达为高水平。在具有肥胖症和代 谢疾病的动物肠道中，GLUT5表达可能会受到影响。但GLUT5对这些疾病的影响存在许多争 议。Noguchi等研究发现饮食中糖类经消化得到的果糖等糖类能促进小肠在糖酵解过程提 高丙酮酸羧激酶等关键酶基因的转录水平，但葡萄糖无此功能。因此，与小肠中葡萄糖的代 谢速度相比，果糖代谢的速度比较快。在小肠GLUT5基因的转录起始位点上游含有一个TATA 盒，在此盒的尾侧有一个同类盒基因CdxA，它主要负责着肠道上皮的分化，而且在其上游处 还含有一处称为上游刺激因子(USF)的片段，该片段为碳水化合物的反应元件。提示CdxA与 USF都和小肠GLUT5基因的表达有着密不可分的联系，而且对果糖浓度的变化也很敏感。
[0005] 糖类转运载体蛋白SGLT1和GLUT5对小肠上皮细胞吸收单糖的机制起着至关重要 的作用，其基因的表达和调控，以及蛋白合成等发生异常均可能引起糖类转运载体在数量 及功能上的各种异常，导致机体出现各种病理变化。糖类转运载体数量的变化可能改变上 皮细胞基底膜的运输能力，如葡萄糖转运过程中改善膳食中碳水化合物的吸收。目前对于 这两种糖类转运载体的具体机制还有待更进一步的研究。
[0006] GATA家族属于锌指总科，其成员在不同生物体中是高度保守的。普遍位于启动子、 转录起始部位的上游或者接近启动子的部位、增强子、位点控制区等部位。GATA转录因子是 一个在结构上与DNA结合蛋白相关的家族，其也对哺乳动物红细胞的生成起到调控作用，在 真菌、果蝇和线虫中都有相同的功能同源性。脊椎动物中的GATA转录因子可细分为两个功 能组，其中GATA1、GATA2、GATA3主要在造血干细胞和神经元细胞中表达，调控胸腺细胞、红 细胞、巨核细胞和神经元细胞的分化;而GATA4、GATA5、GATA6主要在组织的内胚层和中胚层 中表达，参与了肺、肝、肠、性腺的发育和功能。GATA家族成员都包含一个或两个锌指基序 CXNCXnCNXC的结构域，可以结合到基因启动子的一个共同的DNA序列(A/T)GATA(A/G)，直接 激活或抑制目的基因的表达，但激活域和组织分布各不相同。在线虫中已确定了多种GATA 转录因子，它们影响基因参与肠道、真皮和神经组织发育中的细胞迀移、融合等活动。
[0007]GATA3是GATA锌指转录因子家族的一名成员，具有高度保守的C4型锌指结构域，它 在控制细胞的发育、增殖及分化等方面起着重要的作用。GATA3存在于活性的T细胞、胚胎期 的大脑和肾脏中。小鼠GATA3基因CDS区长度为1332bp，编码443个氨基酸，而人GATA3基因 CDS区长度为1335bp，编码444个氨基酸，鸡GATA3基因CDS区长度也为1335bp，编码444个氨 基酸。GATA3含有N-端激活域和两个锌指结构，即为N-端锌指结构和C-端锌指结构。C-端锌 指结构对于DNA的绑定是必不可少的，然而N-端锌指结构能稳固这个绑定，且能与GATA的协 同蛋白（F0G)等其它锌指蛋白相互作用。N-端锌指结构和C-端锌指结构在IL-4，IL-13和IL-5的感应中起着不同的作用。Linda等研究发现脊椎动物中GATA-3转录因子含有几乎完全相 同的DNA序列、识别特性、基本氨基酸序列及mRNA表达特点，还可刺激T淋巴细胞中的特定基 因的表达以及鸡、小鼠和人类大脑的发育。脊椎动物中GATA家族成员的表达差异可能是由 于其与特定细胞协同作用导致的。组织特异性基因的表达受到转录因子的调控，而这些转 录因子将结合到特定的DNA序列上发挥各自的调控作用。
[0008]GATA3首次被克隆作为一种特异性T细胞的转录物，是T细胞发育所必需的转录因 子，能调节T细胞的增殖和分化。GATA3的功能在T细胞的发育中得到广泛应用，参与胸腺细 胞发育的各个方面。生殖细胞中GATA3的缺失会导致胎死，这主要是由于大量的表型异常， 包括生长迟缓，大脑和脊髓的严重畸形，还有胎儿肝脏造血作用的总畸变。研究发现GATA3 调节乳腺上皮细胞的分化，是乳腺上皮细胞中高纯度的转录因子，在细胞生物学中起着很 重要的作用。GATA3已被证明能够促进Th2细胞分泌IL-4，IL-5和IL-13,诱导ThO细胞分化为 T细胞亚型，但是抑制ThO细胞分化为Thl细胞。GATA蛋白具有高度保守性，从细菌到人类均 表达，说明GATA蛋白在细胞的发育和分化中起着重要作用。GATA3在皮肤发育中也扮演着重 要的角色，尤其是在特定内根鞘细胞与毛干细胞的分化过程中具有重要作用。内皮细胞表 型在时间和空间上收到转录和转录后高度调控。GATA3在皮肤和毛囊的发育中起着重要作 用。在皮肤里，上皮细胞经过一个向上分化过程产生不同毛发卵泡家系，如髓质、发根的皮 层和表皮和内根外壳。GATA3在造血组织(如:T细胞)或肾脏、中枢神经系统、皮肤和乳腺等 非造血组织中都表达。GATA3可调控基因的表达，能改变从细胞质到细胞核进入目的基因的 位置，GATA3包含一个经典细胞核输入信号。由于GATA3可以在多种组织中表达，所以GATA3 的表达是至关重要的。例如，肾小管中GATA3的失活会导致输尿管的异常发育和一系列泌尿 生殖器的畸形。它与其他蛋白互作作用有助于GATA3对细胞特异性目标的调控和改变GATA3 的功能。尽管GATA3在肠上皮细胞中表达，但GATA3转录因子在肠上皮细胞中的功能和调控 机制了解却很少，有待进一步研究。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表 达的方法。
[0010] 本发明由如下技术方案实现的：一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白 SGLT1和GLUT5表达的方法，首先对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定，获得培养细胞， 然后利用生物信息学软件寻找SGLT1和GLUT5基因5'上游GATA3基因的结合位点，构建转录 因子GATA3的真核表达载体pcDNA3.1-GATA3,运用脂质体转染法将构建的真核表达载体 pcDNA3.1-GATA3转染鸡小肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，最后利用 实时荧光定量PCR检测cDNA中目的基因GATA3、SGLT1和GLUT5的绝对表达量。
[0011] 具体包括如下步骤： 1. 对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定:取15日龄的鸡胚，无菌操作取出小肠，去 除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块;采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化组 织块，使其形成细胞悬液，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞接 种于细胞培养板，至于40°C7%C02培养箱内培养;将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置相 差显微镜进行形态学鉴定，通过免疫组化进行细胞鉴定，获得培养细胞； 2. 构建转录因子GATA3的真核表达载体pcDNA3.1-GATA3: A. 引物设计:NCBI中查找鸡转录因子GATA3的基因序列信息，按查到的基因序列应用 Primer3.0进行在线引物设计，所设计的引物为GATA3基因PCR克隆引物和GATA3基因荧光定 量PCR引物，引物信息见表1; 表1PCR引物
B.PCR扩增相应的基因片段:使用表1中引物对GATA3基因片段进行PCR扩增反应， C. 纯化回收的PCR产物进行连接转化，制备真核表达载体pcDNA3.1-GATA3:通过凝 胶电泳，对PCR产物的进行割胶回收，纯化得到的PCR产物连接转化至DH5a感受态细胞，菌体 扩大培养，培养好的菌液进行PCR测序鉴定，测序正确的菌液提取GATA3质粒，获得真核表达 载体pcDNA3.1-GATA3; 3.绝对荧光定量PCR反应体系的建立:测序正确的菌液提取GATA3质粒，用微量核酸和 蛋白测定仪测定质粒DNA的浓度和纯度，利