因的引物和退 火温度见表2。
[0064] 表12:SGLT1和GLUT5荧光定量PCR反应体系
表13:SGLT1和GLUT5扩增条件
表2:SGLT1和GLUT5实时荧光定量PCR的引物
利用绝对荧光定量PCR检测转染鸡小肠上皮细胞试验后空白对照组、阴性对照组及转 染组三组中GATA3mRNA的表达量，通过生物统计学软件SAS软件分析如图10可知：转染组 GATA3mRNA的表达量明显远远高于空白对照组和阴性对照组，且差异极显著(P<0.01)，其 中转染组GATA3mRNA的表达量是空白对照组的43.97倍，是阴性对照组的36.49倍。由此可 知，pcDNA3.1-GATA3转染鸡小肠上皮细胞试验成功。
[0065] 7.数据统计分析:根据已知浓度的标准品稀释梯度进行绝对荧光定量PCR，软件 将绘制出标准曲线，并且自动得到未知细胞cDNA的表达量拷贝数。所有数据都采用统计软 件SPSS17.0进行Duncan方法多重比较分析。分析GATA3基因的过表达对GLUT5及SGLT1基因 的表达的影响。
[0066] 转染试验成功后，利用荧光定量PCR仪进行绝对荧光定量检测鸡小肠上皮细胞中 SGLT1和GLUT5基因表达量，试验结束后，系统会生成SGLT1和GLUT5基因的标准曲线和熔解 曲线，并自动导出标准曲线方程和扩增效率。
[0067] 如图11所示，鸡小肠上皮细胞中基因SGLT1荧光定量所得到的标准曲线方程为:Y =-3.512Χ+38(Υ为Ct值，即阈值循环数;X为模板起始量），标准曲线的扩增效率Ε=92.7%，相 关系数R2=〇.999,表明梯度稀释的标准品质粒线性关系良好。利用此基因的标准曲线检测 转染细胞后三组细胞中SGLT1基因的表达量，产生的熔解曲线如图12，峰尖窄且只有单一的 峰，说明PCR产物的Tm值一致，扩增产物中没有非特异性产物产生，也没有引物二聚体出现。 由此可知，此标准曲线可以准确检测出每组样品的拷贝数。
[0068]由图13可知，鸡基因GLUT5绝对荧光定量PCR扩增得到的标准曲线回归方程为￥=_ 3.408X+40(Y为Ct值，即阈值循环数;X为模板起始量），标准曲线的扩增效率E=96.5%，符合 试验规定的范围，相关系数R2=〇.999,表明梯度稀释的标准品质粒线性关系很好。利用其标 准曲线检测转染鸡小肠上皮细胞后三组细胞中GLUT5基因的表达量，得到的熔解曲线如图 14所示，发现熔解曲线都为单峰，且峰值单一，说明所有样品的PCR产物Tm值一致，没有非特 异性产物的生成，也没有引物二聚体的产生。由此可知，此标准曲线能准确检测出每组样品 的拷贝数。
[0069]运用绝对荧光定量PCR检测pcDNA3.1-GATA3转染鸡小肠上皮细胞成功后，再对转 染后三组细胞中SGLT1和GLUT5两种基因进行绝对荧光定量检测其表达量，对所得数据利用 生物统计学软件SAS软件分析所得结果如图15所示可知，转染组中SGLT1基因mRNA的表达量 与空白对照组和阴性对照组相比，三组间差异不显著(P>〇.05)。由此可知，在鸡小肠上皮 细胞中鸡小肠转录因子GATA3过表达后，对糖类营养转运蛋白基因SGLT1表达量的变化没有 起到作用。
[0070] 转染组中GLUT5基因mRNA的表达量极显著高于空白对照组和阴性对照组中GLUT5 基因mRNA的表达量(P<0.01)，且转染组中GLUT5基因mRNA的表达量是空白对照组的1.54 倍，是阴性对照组的1.53倍。由此可知，在鸡小肠上皮细胞中鸡小肠中的转录因子GATA3过 表达后，引起糖类营养转运蛋白基因GLUT5表达量的增高。
[0071] 本发明通过生物信息学软件分析糖类营养转运蛋白SGLT1和GLUT5基因5'上游的 转录因子GATA3的结合位点，结果发现两种糖类转运基因上游都含有多个GATA3的结合位 点，只是各个结合位点的匹配程度各不相同，说明GATA3对SGLT1和GLUT5可能起到调控作 用，为进一步研究转录因子GATA3过表达对两种糖类转运基因的调控机制提供了理论依据。 通过绝对荧光定量的方法证实脂质体转染pcDNA3.1-GATA3进入鸡小肠上皮细胞后实验组 中SGLTlmRNA的表达与对照组并无显著差异，说明GATA3的过表达后对SGLTlmRNA的表达无 明显影响，表明GATA3可能对调节肠道上皮细胞上SGLT1的含量来调节葡萄糖转运量无显著 影响。pcDNA3.1-GATA3成功转染进入鸡小肠上皮细胞后，通过绝对荧光定量PCR检测转染组 中GLUT5mRNA表达量极显著的高于空白对照组与阴性对照组，说明GATA3的过表达可能有助 于促进鸡肠道上皮细胞中GLUT5含量的增加，有助于调节果糖的转运量，促进了糖类的消化 吸收，为进一步深入研究GATA3对糖类转运蛋白基因的调控机理提供了参考依据。
【主权项】
1. 一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表达的方法，其特征在 于:首先对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定，获得培养细胞，然后利用生物信息学软 件寻找SGLT1和GLUT5基因上游GATA3基因的结合位点，构建转录因子GATA3的真核表达载 体pcDNA3.1- GATA3，运用脂质体转染法将构建的真核表达载体pcDNA3.1-GATA3转染鸡小 肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，最后利用实时荧光定量PCR检测cDNA 中目的基因 GATA3、SGLT1和GLUT5的绝对表达量。2. 根据权利要求1所述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5 表达的方法，其特征在于:具体包括如下步骤： 1) .对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定:取15日龄的鸡胚，无菌操作取出小肠， 去除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块;采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化 组织块，使其形成细胞悬液，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞 接种于细胞培养板，至于40°C 7% C02培养箱内培养;将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置 相差显微镜进行形态学鉴定，通过免疫组化进行细胞鉴定，获得培养细胞； 2) .构建转录因子GATA3的真核表达载体pcDNA3.1- GATA3: A. 引物设计:NCBI中查找鸡转录因子GΑΤΑ3的基因序列信息，按查到的基因序列应用 Primer3.0进行在线引物设计，所设计的引物为GATA3基因 PCR克隆引物和GATA3基因荧光定 量PCR引物，引物信息见表1; 表1 PCR引物B. PCR扩增相应的基因片段:使用表1中引物对GATA3基因片段进行PCR扩增反应， C. 纯化回收的PCR产物进行连接转化，制备真核表达载体pcDNA3.1- GATA3:通过凝 胶电泳，对PCR产物的进行割胶回收，纯化得到的PCR产物连接转化至DH5a感受态细胞，菌体 扩大培养，培养好的菌液进行PCR测序鉴定，测序正确的菌液提取GATA3质粒，获得真核表达 载体pcDNA3.1- GATA3; 3) .绝对荧光定量PCR反应体系的建立:测序正确的菌液提取GATA3质粒，用微量核酸和 蛋白测定仪测定质粒DNA的浓度和纯度，利用公式(1)计算出质粒拷贝数： 质粒拷贝数（copies/yL)=质粒浓度(g/yL) X6.02 X 1023(/mol)/质粒的摩尔质量(g/ mol)公式（1);查找到所得质粒的相对分子质量，稀释质粒，将稀释的质粒作为绝对荧光定 量PCR标准曲线的模板，进行绝对荧光定量PCR扩增反应，获得标准曲线和溶解曲线； 4) .GATA3生物信息学分析:通过：软件预测GATA3转录因子对两种 糖类转运蛋白基因 GLUT5、SGLT1上游1500bp的调控区内的结合位点，然后采用脂质体转染 法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞； 5) .转染后鸡小肠上皮细胞RNA的提取及RT-PCR检测:首先收集转染后的鸡小肠上皮细 胞，用37 °C水浴30 min预热好不含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液反复冲洗的收集好的转染后的 鸡小肠上皮细胞，然后提取细胞RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，然后将 RNA反转录合成cDNA; 6) .荧光定量PCR检测GATA3、GLUT5及SGLT1的表达量：用绝对荧光定量PCR测定 pcDNA3.1- GATA3转染试验中空白对照组、阴性对照组细胞目的基因 GATA3、GLUT5及SGLT1 的表达量； 7) .数据统计分析:应用SPSS 17.0统计软件中的Duncans方法对数据进行多重比较，分 析GATA3基因的过表达对GLUT5及SGLT1基因的表达的影响。3. 根据权利要求2述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表 达的方法，其特征在于:所述GLUT5和SGLT1荧光定量PCR的引物为表2; 表2: SGLT1和GLUT5荧光定量PCR的引物4. 根据权利要求2述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表 达的方法，其特征在于:所述提取GATA3质粒是利用大提质粒盒提取得到GATA3质粒。
【专利摘要】本发明属分子生物学和基因工程技术领域，目的在提供转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白<i>SGLT1</i>和<i>GLUT5</i>表达的方法。对鸡小肠上皮细胞体外分离培养获得培养细胞，用生物信息学软件寻找<i>SGLT1</i>和<i>GLUT5</i>基因5′上游<i>GATA3</i>基因的结合位点，构建真核表达载体pcDNA3.1-GATA3，将真核表达载体转染鸡小肠上皮细胞，收集细胞获得cDNA，实时荧光定量PCR检测目的基因<i>GATA3</i>、<i>SGLT1</i>和<i>GLUT5</i>绝对表达量。为家禽营养和育种研究提供部分基因表达调控信息，为阐明糖代谢过程中各基因间互作机制提供理论依据，为培育具高饲料转化率遗传特性的优良鸡种提供分子水平的研究基础。为以提高饲料转化率为目的的选育实践提供理论参考。
【IPC分类】C12N15/67, C12N15/85
【公开号】CN105463017
【申请号】CN201510983849
【发明人】张利环, 李慧锋, 朱芷葳, 张瑜, 李玲香
【申请人】山西农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月24日