毛竹转录因子nac基因cds序列的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及毛竹转录因子NAC基因⑶S序列的应用。
【背景技术】
[0002] NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子家族是植物特有的一类转录因子，多数NAC蛋白的N 端具有高度保守的NAC结构域，而在C端则具有多元化的激活域。NAC转录因子广泛参与调控 许多生物学过程，如细胞分裂、细胞次生壁合成、器官边界、开花和衰老等植物生长发育过 程，以及参与调控植物对高盐、干旱、低温等非生物逆境胁迫响应过程。在拟南芥中过量表 达八财0)19、4财(：055、1?)26/^麻0)72和414?1/^麻(：002均能提高其抗旱能力 ；过量表达 ATAF2/ANAC081的植物更容易感染枯萎病菌;过量表达JUB1/ANAC042和VNI2/ANAC083能够 延迟植物衰老，提高对非生物胁迫的耐受能力。在水稻中过量表达0sNAC5、0sNAC9和 OsNACIO能够显著扩大根系的分布范围，从而提高抗旱能力实现高产;过量表达0sNAC5提高 其抗旱、耐盐的能力；SNAC1转入水稻和小麦，能够提高转基因植株抵抗多种非生物胁迫的 能力。
[0003]竹子是仅次于木材的第二大森林资源，竹产业是我国林业四大朝阳产业之一，竹 子已经被广泛应用于建筑、家具、造纸、装饰材料、食品保健、园林景观、生态修复等领域，是 最具潜力的绿色资源之一。竹子以其生长速度快，繁殖能力强，一次造林，永续利用，适宜山 地造林的特点，在我国造林宜林地日趋减少的情况下，竹林优势更为明显。尤其是目前我国 天然林商业采伐全面禁止的情况下，竹资源的开发利用在保障我国木材安全、生态安全以 及贫困山区农民脱贫致富和新农村建设中具有不可替代的作用。毛竹（Phyllostachys edulis)是我国最为重要的笋、材两用经济竹种，现有面积443万公顷，2014年年产毛竹 13.08亿根，为弥补我国木材缺口做出了积极贡献。以毛竹为材料进行NAC转录因子研究，对 于更好地开发利用毛竹基因资源，开展抗逆分子育种具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供毛竹转录因子NAC基因⑶S序列的应用。
[0005]为了实现本发明目的，本发明提供毛竹转录因子NAC基因CDS序列在促进植物侧根 生长发育中的应用。
[0006]本发明所述的毛竹转录因子NAC基因⑶S序列为：
[0007] i)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；或
[0008]ii)SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0009] iii)在严格条件下与SEQIDNO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 %SDS的0.1XSSPE或含0.1 %SDS的0.1XSSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0010] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0011] 前述的应用，其是将毛竹转录因子NAC基因⑶S序列构建到植物双元表达载体上， 转化植物，从而促进转基因植株侧根生长发育。
[0012] 本发明述及的植物双元表达载体包括PCAMBIA1301、改造的pCAMBIA1301等;其中， 所述改造的PCAMBIA1301是在载体pCAMBIA1301的多克隆位点引入花椰菜花叶病毒35S启动 子和胭脂碱合酶终止子。
[0013] 携带有目的片段的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微 注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，MethodforPlant MolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey， 1998,PlantMolecularBiology,2ndEdition)〇
[0014] 本发明还提供毛竹转录因子NAC基因⑶S序列在提高植物对非生物逆境胁迫的耐 受能力中的应用，所述非生物逆境胁迫包括高盐、干旱等。
[0015] 前述的应用，其是将毛竹转录因子NAC基因⑶S序列构建到植物双元表达载体上， 转化植物，从而提高转基因植株对非生物逆境胁迫的耐受能力。
[0016] 本发明所述的植物包括但不限于拟南芥。将毛竹转录因子NAC基因CDS序列构建到 改造的载体PCAMBIA1301上，转化野生型拟南芥，从而提高转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱 能力。
[0017] 本发明优选采用农杆菌转化法转化植物。
[0018]本发明进一步提供毛竹转录因子NAC基因⑶S序列在植物抗性育种中的应用，所述 植物包括但不限于禾本科植物，例如竹子等。
[0019] 本发明首次发现毛竹NAC转录因子在植物对抗非生物逆境胁迫中的功能，将毛竹 转录因子NAC基因CDS序列导入植物(例如拟南芥）中，得到侧根明显增多的转基因植株，且 转基因植株的耐盐、抗旱能力均明显提高，为植物的抗性育种奠定了基础。毛竹NAC转录因 子基因在竹子等禾本科植物抗性育种中具有广泛的应用前景，为植物速生育种提供了新的 基因资源。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中基因PeSNAC扩增产物电泳图；其中，M:DNA分子量标记；1: 扩增产物。
[0021] 图2为本发明实施例1中毛竹NAC转录因子基因结构示意图。
[0022] 图3为本发明实施例1中多物种NAC氨基酸序列比较分析;其中，A、B、C、D和Ε为Ν端 NAC保守域中的5个亚结构域。
[0023]图4为本发明实施例2中正义植物表达载体PeSNACsense的质粒载体图和酶切检测 电泳图；其中，(A):载体图；（B):酶切检测电泳图，M:DNA分子量标记;1:酶切产物。
[0024]图5为本发明实施例2中反义植物表达载体PeSNACantisense的质粒载体图；其中， (A):载体图；（B):酶切检测电泳图，M:DNA分子量标记;1:酶切产物。
[0025] 图6为本发明实施例3中PeSNACsense单克隆菌落PCR电泳结果;其中，M:DNA分子量 标记；1-6 :转化PeSNACsense的单克隆菌落；7 :PeSNACsense重组表达载体质粒；8: PCAMBIA1301载体质粒。
[0026] 图7为本发明实施例3中PeSNACantisense单克隆菌落PCR电泳结果;其中，M:DNA分 子量标记；1_6:转化PeSNACantisense的单克隆菌落;7:PeSNACantisense重组表达载体质 粒;8:pCAMBIA1301载体质粒。
[0027]图8为本发明实施例4中转基因拟南芥植株RT-PCR检测结果；其中，（A):正义PeSNAC基因表达检测，3-1、3-6、3-8、3-9为不同转基因植株，11'为野生型植株；（8):反义 PeSNAC基因表达检测，六-1^-2^-8^-9为不同转基因植株，11'为野生型植株。
[0028]图9为本发明实施例5中转基因拟南芥表型；其中，1:正义PeSNAC基因表达转基因 植株;2:野生型植株;3:反义PeSNAC基因表达转基因植株。
[0029] 图10为本发明实施例6中转基因拟南芥根系表型及侧根数量统计;其中，WT:野生 型植株;S-1:正义PeSNAC基因表达转基因植株;A-2:反义PeSNAC基因表达转基因植株。
[0030] 图11为本发明实施例7中NaCl胁迫条件下转基因拟南芥表型、存活率统计、Fv/Fm的 变化趋势;其中，WT:野生型植株;S-1:正义PeSNAC基因表达转基因植株;A-2:反义PeSNAC基 因表达转基因植株；（A) :NaCl处理7d后的表型；（B) :NaCl处理10d后存活率统计；（C):NaCl 处理过程中Fv/Fm的变化趋势。
[0031] 图12为本发明实施例8中干旱胁迫条件下转基因拟南芥表型、存活率统计、Fv/^的 变化趋势;其中，WT:野生型植株;s-1:正义PeSNAC基因表达转基因植株;A-2:反义PeSNAC基 因表达转基因植株；（A):干旱处理14d后的表型；（B):干旱处理20d后存活率统计；（C):干旱 处理过程中Fv/Fm的变化趋势。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW, Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0033]实施例1毛竹NAC转录因子基因⑶S序列的获得
[0034] 以毛竹(Phyllostachysedulis)叶片为材料，提取叶片总RNA，并反转录成cDNA作 为模板，从毛竹基因组数据库中搜索，分析找到基因组中预测为编码转录因子NAC的DNA序 列，根据该序列的编码区设计如下引物：
[0035]上游引物：5' -ATGGTGGAGGCGAGGCTGC-3'
[0036]下游引物：5' -TCAATCGAGTGAGTTCCACATCTGTGA-3'
[0037] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测（图1 )，切下目的条带纯化回收，将回收 的DNA片段连接到pGEM-Teasy载体上，转化大肠杆菌(Esherichiacoli)DH5a感受态细胞， 经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，插入片段为867bp， 如SEQIDNo: 1所示。应用Blast在线软件，将测序的片段与已报道的基因序列进行同源性 比较，发现该插入片段与预测的NAC基因编码区完全一致，同时与基因组序列比对分析发 现，该编码区对应的基因组序列含有2个内含子和3个外显子（图2)。将该基因命名为PeSNAC (即，毛竹NAC转录因子基因⑶S序列）。
[0038]通过Blast软件在线比较分析，发现该基因编码的氨基酸序列（SEQIDN〇:2)与其 它单子叶植物的NAC均具有较高的一致性，尤其与同是来自禾本科的水稻(Oryzasativa IndicaGroup)、二糖短柄草（Brachypodiumdistachyon)、谷子（Setariaitalica)、大麦 (Hordeumvulgaresubsp·vulgare)、小麦（Triticumaestium)、节节麦（Aegilops tauschii)和玉米（Zeamays)同源蛋白的一致性都在80 %以上，其中与水稻的NAC (EAZ02065)的一致性最高，达87.0%，N端NAC保守域包含A、B、C、D和E5个亚结构域（图3)。 由此可见，克隆出的PeSNAC基因为毛竹中的一个全新的NAC转录因子基因。
[0039]实施例2携带毛竹PeSNAC基因的植物表达载体构建
[0040]以毛竹cDNA为模板，根据SEQIDNo: 1设计引物，植物表达引物两端分别引入位点Clal和BamHI酶切位点，进行PCR扩增。引物序列如