下：
[0041] 正义植物表达载体上游引物:57 -CCatcgatATGGTGGAGGCGAGGCT-3'，引入Clal酶切 位点。
[0042]正义植物表达载体下游引物：5' -CGggatccTCAATCGAGTGAGTTCCACAT-3'，引入BamHI酶切位点。
[0043] 反义植物表达载体上游引物：57 -CGggatccATGGTGGAGGCGA-3'，引入BamHI酶切位 点。
[0044]反义植物表达载体下游引物:57 -CCatcgatTCAATCGAGTGAGTTCCACAT-3'，引入Clal 酶切位点。
[0045]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA 片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5a感受态细胞，经蓝 白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，分别得到含有Clal位点 序列、编码毛竹NAC转录因子的脱氧核糖核苷酸序列(CDS序列）、BamHI位点序列的质粒pT-PeSNACsense，含有BamHI位点序列、编码毛竹NAC转录因子的脱氧核糖核苷酸的反义序列 (反向⑶S序列）、ClaI位点序列的质粒pT-PeSNACantisense。
[0046]将质粒PT-PeSNACsense、pT-PeSNACantisense以及改造后的质粒pCAMBIA1301(即 在质粒PCAMBIA1301的多克隆位点引入花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子和胭脂碱合酶 (N0S)终止子)分别在37°C条件下分别用双酶切(Clal和BamHI)6h，酶切产物分别进行1%琼 脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，用T4DNA连接酶16°C连接过夜。连接产物转化DH5a感受 态细胞，挑取卡那霉素抗性(50mg·I/1)平板上长出的单克隆菌落，提取质粒，进行PCR鉴定 和酶切图谱鉴定。将获得的重组表达载体分别命名为PeSNACsense和PeSNACantisense，重 组表达载体图及酶切图谱分别如图4和图5所示。
[0047]实施例3重组表达载体转化宿主细胞、阳性克隆鉴定
[0048] 分别将实施例2中构建的正义、反义植物表达载体PeSNACsense和PeSNACantisense通过电击的方法转入农杆菌菌株EHA105感受态细胞中，挑取Kan抗性平板 上长出的单菌落进行PCR鉴定。以重组表达载体转化后形成的单克隆菌落为模板，用实施例 2中引物进行PCR检测，同时以重组质粒和pCAMBIAl301质粒为对照。菌落PCR产物的电泳结 果表明，转化PeSNACsense质粒的单克隆菌落和重组质粒pCAMBIA1301质粒均含有目的基因 片段，而PCAMBIA1301质粒没有扩增出目的基因片段（图6);转化PeSNACantisense质粒的单 克隆菌落和重组质粒pCAMBIAl301质粒均含有目的基因片段，而pCAMBIAl301质粒没有扩增 出目的基因片段(图7)。因此，含有目的基因的工程菌株可用于侵染转化实验。
[0049] 实施例4毛竹PeSNAC基因转化拟南芥及RT-PCR检测
[0050]利用实施例3中获得的工程菌株，采用蘸花法分别转化野生型拟南芥(WT)。通过连 续抗性(潮霉素B50mg·I/1)筛选，最终获得不分离的T3代正义、反义抗性株系各9个。采用RT-PCR阳性检测方法，分别随机选择4个株系进行检测(转正义PeSNAC株系：S-l，S-6，S-8， S-9;转正义PeSNAC株系:△-14-2 4-8 4-9)，以拟南芥厶切1^911丨衍11(匪180850)基因为内参 (AtUbiquitin-FW-ATGGCTGAAGAGGATATCCAGC-SlPAtUbiquitinU7-GAAACACTTCATATGGACGATGG-3')。结果表明，在转正、反义PeSNAC株系中均检测到了目的片 段，而在野生型植株中未检测到目的片段（图8)，证明目的基因在转基因植株中得到了表 达。
[0051 ]实例5转PeSNAC基因拟南芥植株表型分析
[0052]对转基因植株的表型观察发现，与野生型相比，转正义PeSNAC基因的拟南芥植株 生长速度相对较快，抽薹较早，而转反义PeSNAC基因植株生长较慢，抽薹时间较晚（图9)，且 其中A-1株系在生长初期(两周左右），出现非对称叶，或者小叶、缺叶等现象，生长严重受到 抑制。
[0053]实例6转PeSNAC基因拟南芥植株侧根数量统计分析
[0054]随机选取转正义PeSNAC拟南芥株系S-1和转反义PeSNAC拟南芥株系A-2分别进行 垂直培养，观察根系表型。结果显示，与同期野生型植株相比，S-ι的侧根数量多且长，而A-2 的侧根数量少且短。统计表明，野生型植株平均侧根数量为2.35 ± 0.55，S-1平均侧根数量 为3.52±0.37，A-2平均侧根数量为0.98±0.28(图10)。由此表明，正义PeSNAC基因能够促 进转基因植株的侧根发育，而反义PeSNAC基因则抑制侧根发育。
[0055]实例7转PeSNAC基因拟南芥植株耐盐能力分析
[0056]挑选正义转基因株系S-1和反义转基因株系A-2进行耐盐能力实验，在1/2MS培养 基上播种S-ι和A-2萌发7d后，将转基因植株转移至含有NaCl(300mmol·I/1)的培养基上培 养，同时以拟南芥野生型为对照。结果表明，在NaCl处理7d后，野生型和A-2叶片分别出现不 同程度叶片萎蔫，失绿等现象，其中A-2出现这种表型较为严重，而S-1植株叶片持绿性和伸 展性相对较好（图11A)。处理10d后的存活率统计表明，野生型的存活率约为55%，S-1株系 植株存活率约达85 %，而A-2株系存活率仅约为23 % (图11B)。
[0057]叶绿素荧光动力学及其参数是以植物体内叶绿素荧光为探针的一种快速、灵敏、 无损伤地探测逆境对光合作用影响和生理状态的理想方法。最大光化学效率(Fv/Fm)是反映 逆境条件下光抑制的重要参数。测定结果表明，在NaCl胁迫条件下，转基因植株和野生型的 Fv/^值均呈下降趋势，而在NaCl处理初期Fv/Fm值相差不大，随着处理时间的延长各株系Fv/ Fm值均出现不同程度的下降，其中S-1植株Fv/Fm值下降趋势最缓慢，转A-2植株Fv/Fm下降趋 势在l-2d和4-7d时较快，中间时间段相对较慢（图11C)。由此表明，在NaCl胁迫条件下，转正 义PeSNAC基因有助于提高转基因植株的耐盐能力，维持较高的光合效率。
[0058]实例8转PeSNAC基因拟南芥植株抗旱能力分析
[0059] 在1/2MS培养基上播种S-1和A-2萌发7d后，将转基因植株转移至含有TOG6000 (30 % )的培养基上模拟干旱处理，同时以拟南芥野生型为对照。结果表明，在PEG6000处理 14d后野生型和A-2植株均出现叶片失绿、发白直至死亡现象，其中A-2尤为严重，而S-1叶片 虽也有不同程度的萎蔫现象，但叶片持绿效果明显优于野生型植株（图12A)。处理20d后的 存活率统计表明，野生型的存活率约为52%，S-1植株存活率约达76%，而A-2株系存活率仅 约为3%(图12B)。
[0060] Fv/Fm测定结果表明，在PEG6000处理过程中转基因植株和野生型的？￥八^值均呈下 降趋势，其中l-6d内Fv/Fm值的下降幅度均较小。随着处理时间的延长，在6d后A-2和野生型 植株的Fv/Fm值均迅速下降，其中A-2植株的Fv/Fm值下降更快，而S-1植株的Fv/Fm值下降相对 较慢（图12C)。由此表明，在PEG6000模拟干旱胁迫条件下，转正义PeSNAC基因有助于提高转 基因植株的抗旱性。
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 毛竹转录因子NAC基因CDS序列在促进植物侧根生长发育中的应用，其中，所述毛竹 转录因子NAC基因⑶S序列为： i)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；或 ii)SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQIDNO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 %SDS的0.1XSSPE或含0.1 %SDS的0.1XSSC溶液中，在65°C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其是将毛竹转录因子NAC基因CDS序列构建 到植物双元表达载体上，转化植物，从而促进转基因植株侧根的生长发育。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体包括pCAMBIA1301、 改造的PCAMBIA1301;其中，所述改造的pCAMBIA1301是在载体pCAMBIA1301的多克隆位点引 入花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合酶终止子。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用农杆菌转化法转化植物。5. 根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。6. 毛竹转录因子NAC基因CDS序列在提高植物对非生物逆境胁迫的耐受能力中的应用， 所述非生物逆境胁迫包括高盐、干旱;其中，毛竹转录因子NAC基因CDS序列的定义同权利要 求1所述。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其是将毛竹转录因子NAC基因CDS序列构建 到植物双元表达载体上，转化植物，从而提高转基因植株对非生物逆境胁迫的耐受能力。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体包括pCAMBIA1301、 改造的PCAMBIA1301;其中，所述改造的pCAMBIA1301是在载体pCAMBIA1301的多克隆位点引 入花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合酶终止子;优选采用农杆菌转化法转化植物。9. 根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。10. 毛竹转录因子NAC基因⑶S序列在植物抗性育种中的应用，所述植物包括禾本科植 物;其中，毛竹转录因子NAC基因CDS序列的定义同权利要求1所述。
【专利摘要】本发明首次发现毛竹NAC转录因子在植物对抗非生物逆境胁迫中的功能，将毛竹转录因子NAC基因CDS序列导入植物(例如拟南芥)中，得到侧根明显增多的转基因植株，且转基因植株的耐盐、抗旱能力均明显提高，为植物的抗性育种奠定了基础。毛竹NAC转录因子基因在竹子等禾本科植物抗性育种中具有广泛的应用前景，为植物速生育种提供了新的基因资源。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105463015
【申请号】CN201511032583
【发明人】高志民, 王丽丽, 赵韩生, 孙化雨, 李利超
【申请人】国际竹藤中心
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月31日