一种增强hUCMSCs增殖能力的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种增强hUCMSCs增殖能力的方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源 于发育早期的中胚层和外胚层。MSCs具有自我复制、大量增殖、多方向分化潜能、造血支持 以及免疫调控等特性。现阶段主要从脂肪、骨髓、脐带、脐血组织中提取MSCs。人脐带间充质 干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)，是存在于脐带中的 一种MSCs，其具有取材方便，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反 应，避免了伦理争议，细胞数量多等优点。
[0003] hUCMSCs在临床疾病研究应用中有着重要意义，如能通过相应的诱导将hUCMSCs分 化为我们需要的细胞，移植于病变部位促进病变的愈合。
[0004] hUCMSCs生物学特征及研究进展：
[0005]间充质干细胞是一类具有自我更新增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先 由friedenstein等从骨髓中发现。da.liang研究发现，间充质干细胞具有向内中外三个胚 层包括肌腱、韧带、干细胞、心肌细胞和骨髓基质细胞等分化发育的潜能。而成人骨髓源间 充质干细胞数量级增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且供者间充质干细胞的采集须行骨 髓穿刺，由于疾病的原因，患者常患有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓间充质干细 胞的应用。因此，寻找新的间充质干细胞来源是目前国内外干细胞研究的热点，hUCMSCs具 有来源丰富、对供者无影响。易于采集和运输。无一体排斥反应、避免伦理争执等诸多优点， 因此，hUCMSCs有望成为骨髓间充质干细胞的理想替代来源。
[0006] hUCMSCs与骨髓间充质干细胞一样是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干 细胞。理论上，在一定条件下，hUCMSCs可以定向分化成机体内的各种功能细胞，形成任何类 型的组织以及器官，具有"可塑性"。并且，与骨髓间充质干细胞相比，hUCMSCs具有诸多优点 而成为近年来医学界的研究热点。
[0007] 小核仁RNA(smallnucleolusRNAs，snoRNAs)是一类发现较早且位于核仁内的小 非编码RNA，在核糖体RNA(ribosomalRNA，rRNA)、信使RNA(messengerRNA，mRNA)、小核RNA (smallnuclearRNA，snRNA)的成熟及修饰中均发挥重要作用。snoRNAs的功能及其作用途 径一直以来均是学术界的研究热点。目前，snoRNAs对rRNA的化学修饰作用已得到广泛认 可。另外，有研究表明snoRNAs与一些遗传疾病以及肿瘤性疾病的发生发展存在密切关联。 随着研究的深入，snoRNA在调控细胞增殖方面的作用越来越受到大家重视。
[0008]研究发现，部分snoRNA对细胞的增殖具有调控作用，（参见文献：Pacilli，A.，Ceccarelli,C.,Trere,D.,&Montanaro,L..SnoRNAU50 levelsareregulatedbycell proliferationandrRNAtranscription.IntJMolSci,2013?14(7)：14923-14935.)
[0009] 目前尚无有关snoRA7A维持并增强hUCMSCs增殖能力的研究及应用。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供sn0RA7A的新用途，本发明的另一目的在于提供利用 snoRA7A来维持和/或增强hUCMSCs增殖能力的应用。
[0011] 为了实现上述目的，申请人构建了含目的基因sn〇RA7A的过表达质粒载体将其转 染hUCMSCs，以获得snoRA7A高表达，称之为snoRA7A°e-hUCMSCs。通过CCK8测量各组细胞的增 殖速度。本发明的主要技术方案如下：首先是根据sn〇RA7A的基因结构，设计引物，以 hUCMSCs总DNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备snoRA7AcDNA，再构建PLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体用于转染hUCMSCs。
[0012]本发明的第一方面，提供sn〇RA7A的新用途。
[0013]本发明提供了snoRA7A在体外培养条件下维持和/或增强hUCMSCs增殖能力的应 用，也即snoRA7A在制备hUCMSCs体外培养试剂中的应用。
[0014]所述的sn〇RA7A，其具体序列为：
[0015]
[0016]所述的试剂，用于维持和/或增强hUCMSCs增殖活性，并有助于其干性的维持。
[0017] 本发明所述的维持和/或增强hUCMSCs增殖活性，是指hUCMSCs在体外培养条件下， 随着传代次数增加，可减缓细胞增殖能力的降低，细胞倍增时间以及细胞活性不会降低，BP hUCMSCs增殖能力不会降低。
[0018] 本发明所述的hUCMSCs通过机械法结合酶消化法的方式获得原代细胞或传代细 胞。
[0019] 本发明的第二方面，提供了一种利用sn0RA7A来维持和/或增强hUCMSCs体外培养 条件下增殖能力的方法，该方法包括以下步骤：
[0020] A、构建snoRA7A的重组质粒；
[0021]B、将步骤A获得的重组质粒转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs。
[0022]所述的步骤A构建的重组质粒为:pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体。所述的重 组人pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体，转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs， 称之为snoRA7A°e-hUCMSCs〇
[0023]所述的步骤A具体为：首先根据sn〇RA7A的基因序列（如SEQIDN0:1)，以及所选载 体PLKD-CMV-G&PR-U6，分别选取Agel、BamHI为酶切位点设计上下游引物，以hUCMSCs总DNA 为模板，通过RT-PCR获取含酶切位点序列的目的片段。分别酶切目的片段和载体，再通过其 两端所含酶切位点直接连入酶切后的PLKD载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细 胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆 即为构建成功的pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A真核表达载体。
[0024] 步骤A中获取目的片段所用引物序列为：
[0025] snoRA7A Agel F:
[0026] 5，CATTCCCAGCTTGCTCCGTA3，（SEQIDN0:2)
[0027] snoRA7ABamHIR:
[0028] 5，GGGATCCCGCACTGTCG 3，（SEQ ID N0:3)
[0029]其中真核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(著[美]J.莎姆布鲁克， 黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社）。
[0030]所述的步骤B中转染步骤如下：
[0031 ]按fugen-6(微升）：质粒(微克）= 4:3的比例对生长至60%~70%融合的细胞进行 转染，24小时后更换新的培养基，获得snoRATAM-hUCMSCs。
[0032]在本发明一个更优选实施例中，转染步骤具体为：
[0033] 取97ul DMEM到lml 0D管中，加入3yg过表达质粒到DMEM中，用加样枪混匀或拿手 指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时4μ1 fugene6到预混的DMEM中，轻轻混勾，静置15分 钟。15分钟后用100ul枪吸出反应液，均匀的滴入6孔板中，轻轻拍打。放入培养箱。24小时后 观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基，获得snoRATAm-hUCMSCs。
[0034] 本发明的第三方面，提供了上述方法获得的snoRA7A°e-hUCMSCs，S卩snoRA7A高表达 的hUCMSCs。
[0035] 继续培养，观察snoRA7A°e-hUCMSCs的生长状态，以及是否维持成纤维样生长状态， 细胞增殖所需时间。实验重复三次，均可发现snoRA7A°e-hUCMSCs同对照组（用载体pLKD-CON转染的毛乳头细胞:CON-hUCMSCs)相比可更好的维持成纤维样，细胞增殖快。
[0036]本发明优点在于：
[0037] 本发明成功构建了snoRA7A高表达的hUCMSCs，较hUCMSCs具有更高的增殖能力，且 多能性更好;可在体外培养条件下，获取大量功能状态较好的细胞，解决了hUCMSCs在体外 培养过程中随着传代次数增加，增殖能力等生物活性降低的问题;本发明为hUCMSCs体外培 养传代过程中细胞增殖能力的维持以及增强提供了新思路，为hUCMSCs的临床应用提供了 更广阔的前景。
【附图说明】
[0038] 图1为分离培养的hUCMSCs;其中A为snoRA7A高表达的第3代hUCMSCs，B为snoRA7A 高表达的第5代hUCMSCs，C为snoRA7A高表达的第7代hUCMSCs，D为snoRA7A高表达的第9代hUCMSCs，E为空载体转染的第3代hUCMSCs，F为空载体转染的第5代hUCMSCs，G为空载体转染 的第7代111^1^〇8，!1为空载体转染的第9代。可见811〇1^74° (3-111^1^〇8成纤维样生长状态维持 较空白组好，且培养相同时间后细胞密度较空白组高。
[0039] 图2为实时PCR的检测结果，表明在第3代hUCMSCs中，snoRA7A表达量增加在 snoRA7A°e-hUCMSCs中较CON-hUCMSCs显著增加。提示转染效率高。
[0040] 图3是过表达snoRA7A及其对照组的第3代hUCMSCs经传代后细胞总体活性的变化， 染色越深0D值越高，表示活细胞数越多。由于各组细胞起始数相同，因此，0D值可用于指示 细胞增殖能力。由图3可知，过表达snoRA7A后细胞0D值较对照组高，且呈逐渐增长趋势，表 明过表达snoRA7A后hUCMSCs增殖活性增强。
[0041] 图4是过表达snoRA7A及其对照组的第3代hUCMSCs经传代后细胞倍增时间的变化。 由图看以看出，过表达snoRA7A后hUCMSCs细胞倍增时间明显缩短，细胞增殖加快。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0043] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0044] 实施例 1 :构建真核表达载体pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A，感染hUCMSCs (HUCMSCS)。
[0045] l、hUCMSCs分离培养
[0046] 人脐带来自长海医院妇产科。原代培养得到hUCMSCs。因随传代次数增加，hUCMSCs 的形态及增殖速率会发生变化，为保证实验的准确性和可靠性，我们所有的体外实验均选 择第2代hUCMSCs为研究对象。
[0047] 2、制备人基因组DNA
[0048] 用Promega的Wizard?基因组DNA纯化试剂盒，方法如下：
[0049] [ 1 ]·收集hUCMSCs至一干净的 1 ·5ml0D管中；
[0050] [2].加入600微升核裂解液，用移液枪反复吹打以裂解组织，直到可见的组织块消 失，65°C静置 20min;
[0051 ] [3].加入3微升RNA酶，颠倒2-5次，37°C30min，然后冷却至室温。
[0052] [4].加入200微升蛋白沉淀液并使用涡旋振荡器高速剧烈振荡20sec，转移至冰上 冷却5min;
[0053] [5].室温12000rpm离心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；
[0054] [6].小心移取上清(含DNA)至