SM22758、PantoeaeucalyptiDSM23077、 PantoeaanthophilaDSM23080、PantoeaagglomeransDSM30072和Pantoeadispersa DSM30073均为德国DSM菌种保藏中心的菌株。
[0027] 下述实施例中的PantoeaagglomeransJCM1236和Pantoeaagglomerans JCM20143为日本JCM菌种保藏中心的菌株。
[0028]实施例1、利用PCR引物对ATF-ATR鉴定北京泛菌 [0029] 1、鉴定北京泛菌的PCR试剂
[0030] 本实施例的鉴定北京泛菌的PCR试剂由北京泛菌特异引物对ATF-ATR、2XTaqPCR Mix(Bioeasy)和ddH2〇 组成。
[0031] 其中，北京泛菌特异引物对ATF-ATR由ATF(上游引物）和ATR(下游引物)组成，ATF 的核苷酸序列是5'GAGAATCTAGCTAGTCAAACCTATGGGAAC3'（SEQIDNo.l)，ATR的核苷酸序 列是5'GATACTTTCGACATCGCGATATATTTGCCA3'（SEQIDΝο·2)。
[0032] 2、鉴定北京泛菌
[0033] 2.1、提取菌株的DNA
[0034] 从-80°C保存的菌种（北京泛菌（Pantoeabeijingensissp.nov. )JZB2120001T; PantoeagaviniaeDSM22758；PantoeaeucalyptiDSM23077；Pantoeaanthophila DSM23080；PantoeaagglomeransDSM30072；PantoeadispersaDSM30073；Pantoea agglomeransJCM1236；PantoeaagglomeransJCM20143或Pantoeapleuroti sp.nov.JZB2120015T)在固体LB培养基中划线，28°C培养20h，用接种环挑取各细菌菌株单 个菌落接于装有LB培养基(3mL)的试管中，以200rpm28°C振荡培养18h。
[0035] 将各供试菌株用DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN)提取总DNA作为PCR模板，按 照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：
[0036] 1)收集2ml细菌培养液，12000rpm离心lmin，去掉上清。
[0037] 2)加入 180μ1BufferATL，20yl蛋白酶Κ，4μ1RNaseA，56°C处理 1 小时。
[0038] 3)振荡 15s，加入200μ1bufferAL混匀。
[0039] 4)加入200μ1 无水乙醇，8000rpm离心 3min。
[0040] 5)上清收集到离心柱中，8000rpm离心lmin。
[0041 ] 6)在离心柱中加入500μ1BufferAW1，8000rpm离心lmin。
[0042] 7)在离心柱中加入500μ1BufferAW2,8000rpm离心lmin。
[0043] 8)将离心柱放到一个新的1.5ml离心管上，加入50μ1BufferAE，室温放置lmin， 8000rpm离心lmin，所得即为细菌的总DNA。
[0044] 2.2、PCR扩增
[0045]分别以2.1提取的各菌株的总DNA为模板，利用步骤1的北京泛菌特异引物对ATF-ATR进行PCLPCR反应体系（20yL):10ymol.L-1 的上、下游引物各lyL，2XTaqPCRMix (Bioeasy) 10yL，模板DNAlyL，ddH20 7yLJCR反应条件：95°C，5min; 95°C，30s，66°C，30s， 72°Clmin，30个循环;72°C延伸1Omin。1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0046] 利用引物对16spl-16sp2PCR扩增各菌株的16srDNA片段。引物对16spl-16sp2由 16spl(序列为5 'AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT3'）和16sp2(序列为5' TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC3'）组成。PCR反应体系（20μυ:10μπιο1 ·L-1的上、下游引 物各lyL，2XTaqPCRMix(Bioeasy)10yL，模板DNAlyL，ddH20 7μΙ^ΡΟ?反应条件：95°C， 5min; 95°C，30s，55°C，30s，72°C2min，30 个循环;72°C延伸lOmin。1 % 琼脂糖凝胶电泳检测。 [0047]结果表明引物对16spl-16sp2在供试的9个菌株中均能扩增出目的条带，说明供试 菌株的DNA提取效果良好（图1)。北京泛菌特异引物对ATF-ATR只能以北京泛菌(Pantoea beijingensissp.nov. )JZB2120001T为模板扩增出大小为500-700bp条带，其它8个菌株没 有该500_700bp条带（图2)。回收北京泛菌（Pantoeabeijingensissp·ηον·)JZB21200011" 的500-700bp条带，进行测序，结果表明该500-700bp条带的大小为630bp，其序列为SEQID No.3。说明北京泛菌特异引物对ATF-ATR是北京泛菌的特异引物对，可用于快速鉴定北京泛 菌。
【主权项】
1. 北京泛菌特异引物对，由引物ATF和引物ATR组成；所述引物ATF为SEQIDNo. 1所示 的单链DNA分子;所述引物ATR为SEQIDNo. 2所示的单链DNA分子。2. 鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒，包括权利要求1所述的北京泛菌特异引 物对。3. 权利要求1所述的北京泛菌特异引物对的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物 对的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。4. 权利要求2所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物对的所 述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。5. 权利要求1所述的北京泛菌特异引物对在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。6. 权利要求2所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。7. 鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组DNA为模板，用权利 要求1所述的北京泛菌特异引物对进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如 果所述PCR产物含有500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品为北京泛菌或含有北京泛菌， 或者所述待测生物样品候选为北京泛菌或候选含有北京泛菌；如果所述PCR产物不含有 500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品不为北京泛菌或不含有北京泛菌，或者所述待测 生物样品候选不为北京泛菌或候选不含有北京泛菌。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述500-700bp的DNA片段为630bp的DNA片 段。 9.SEQID吣.3所示的0嫩分子。 10.SEQIDNo.3所示的DNA分子在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。
【专利摘要】本发明公开了鉴定北京泛菌的方法及其所用引物对。该鉴定北京泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组DNA为模板，用北京泛菌特异引物对ATF-ATR进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品为北京泛菌或含有北京泛菌；如果所述PCR产物不含有500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品不为北京泛菌或不含有北京泛菌。北京泛菌特异引物对ATF-ATR只在北京泛菌的基因组DNA中扩增出了特异条带，在其它菌株中均没有得到扩增产物，北京泛菌特异引物对ATF-ATR可用于快速鉴定北京泛菌。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/01
【公开号】CN105463106
【申请号】CN201610006534
【发明人】荣成博, 刘宇, 赵爽, 王守现, 马元伟, 许峰, 宋婧祎, 李瑞杰, 黄斌, 王晶, 王兰青, 宋爽, 牛玉蓉
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月4日