lal62改善了活性残基附近的微环境，增加了在较高环境 pH下的适应性。
[0136] 温度对H162AR363H的影响。可知，其最适温度为30°C，这和野生型DBAT及R363H并 没有差别。
[0137] (5)D166HR363H
[0138] His残基首先质子化，再夺取乙酰辅酶A上羰基碳的电子。利用定点突变技术，在 DBAT中同时引入2个His位点，这和原有的Hisl62-起，极有可能提升酶活性。
[0139] 我们仅以研究了pH对其活性的影响。可知，突变体D166HR363H的最佳pH是6,这和 H162AR363H-致，和R363H(pH=3)和野生型DBAT(pH=7)相差较大。推测这和Hisl66残基同 样改善了反应微环境，说明Hi s 162、His 166和Hi s363彼此形成微环境，His在酸性环境下更 易质子化，从而发动亲核攻击。
[0140] 温度对D166HR363H酶活性的影响。可知，其最适温度为30°C。这和上述所有的突变 体一样，表明这些位点的突变不能改变酶分子对温度的适应性。
[0141] (6)理性改造酶的酶学动力学常数
[0142] 根据DBAT的酰基转移机理，通过对非天然酰基供体的利用分析，我们认为酰基供 体上的羰基氧距离活性残基的距离和酶的活性呈现线性相关。在野生型DBAT中，H162、D166 和R363距离乙酰辅酶A的距离相当，自然这就成了酶理性设计的起点，于是就构建了 !116241?363!1、01664、0166!1、1?363!1和0166邢363!1等5个理性设计的酶。
[0143] 在经过大量表达，纯化后，我们对上述突变体的米氏常数、催化效率等性质进行了 表征(表2)。结果表明，在H162AR363H中，单一催化位点H363同样可完成催化，表现出和WT相 当的催化效率。将酶的活性残基增加到两个后，即单点突变D166H与R363H，酶的效率常数比 野生型增加了 11倍和12倍，催化效率相似。继续增加到三个后，酶的效率常数提高了 39倍， 表明将两个活力提高的突变具有加和作用或者协同作用，简单的累加可以进一步提升其催 化活性。
[0144] 表2突变体的催化效率表征
[0145]
[0146] (二)非天然底物拓展
[0147] (1)H162AR363H
[0148] 虽然乙酰辅酶A可作为H162AR363H的酰基供体，且其转化效率和WT相当。但测试的 酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6和酰基供体7均不能 被突变体利用。推测这些化合物产生醛类导致活性残基被破坏。
[0149] (2)D166H
[0150] 突变体D166H对酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4和酰基供体6的转化效率极低， 几乎不能被利用。但对酰基供体1、酰基供体5和酰基供体7有较高的催化效率（图3)。从图中 可看出，随着添加量的递增，转化效率也相应增加。
[0151] (3)R363H
[0152] 突变体R363H均能利用酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、 酰基供体6和酰基供体7。其中，对酰基供体1和酰基供体7有较高的催化效率(图4)。
[0153] 我们进一步分析了突变体R363H对不同酰基供体的偏好性。可知，R363H对酰基供 体1和酰基供体5具有较高的催化活性，其次是酰基供体7。这个与野生型的DBAT相似，我们 认为酰基供体的侧链结构越复杂，转化成产物的效率越高。
[0154] (4)D166HR363H
[0155] 我们同样测试了双突变体D166HR363H对酰基供体利用情况。结果表明，该突变体 均能较为高效的利用酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6 和酰基供体7。其中，当酰基供体6的添加量超过1 %时和酰基供体7添加量超过2.5 %时，产 量均逐渐下降（图5)。表明该突变体对不同的酰基供体具有不同的耐受性。
[0156] 同理，我们进一步分析了突变体D166HR363H对不同酰基供体的偏好性。可知， D166HR363H对酰基供体1、酰基供体5和酰基供体7具有较高的催化活性。这个与野生型的 DBAT、R363H 相似。
[0157] (三)进化路线
[0158] Kcat/Km是酶的催化效率常数（specif icity constant)。对于同一底物而言， Kcat/Km值越大，表示酶的活性越大。以乙酰辅酶A为酰基供体，突变体H162AR363H和WT相 当，表明R363位点可以作为新的催化位点。而D166H和R363H分别比WT提高了大约11倍和12 倍，这表明这两个位点均可以设计为新的活性残基。D166和R363结合起来，比WT提高了约39 倍，这不仅表明对酶的设计和改造是合理的，而且进一步确认了在DBAT催化的中，His是发 动亲核攻击的关键残基，在合理的范围内，增加 His的数目，可以增加酰基供体的羰基氧受 至IjHis的咪唑基团的攻击的机会，从而增加酶的活性。
[0159] 另外，我们那把这些设计酶进行非天然酰基供体的测试。结果表明，H162AR363H对 多数均不能催化，推测这是因为这些烯醇酯产生了醛类，破坏了新引入的H363残基，从而导 致活性下降。而对于D166H、R363H和D166HR363H来说，均在不同程度上提高了对这些非天然 底物的利用率(图6)。其中，野生型的对酰基供体7没有活性，而这三个突变体均能较高效的 利用。酰基供体1的利用率分别提高了74、100和143倍，推测在较多数目的活性His下，羰基 氧更容易受到亲核攻击。
[0160](四）结论
[0161] 通过理性设计快速有效的提升酶的催化活力一直是蛋白质工程领域的研究热点。 它不仅能够为加深理解酶分子的结构与功能关系提供可具体案例，同时也能为工业生产提 供优秀的新酶源。在本章中，我们利用分子对接的方法，快速准确的在酶活性中心找到靶标 位点，即D166和R363。通过定点突变技术，获得了突变体，并对突变体进行性质表征。其中， 以乙酰辅酶A为酰基供体，H162AR363H的催化效率和野生型相当，而D166H、R363H和 D166HR363H的催化效率均比野生型提高了 11倍、12倍和39倍。对于非天然底物，这些突变体 表现出不同的性质，多数能同样增加效率。对于这再一次证明了针对活性中心的改造是一 种迅速、高效的进化酶活性的方法。
[0162] 另外，DBAT催化的酰化作用是有其关键残基Hisl62主导的。在不改变酶分子的溶 剂通道的前提下，通过在有效的范围内，仅仅简单的增加 His数目就可以叠加酶的效率，因 此，本例也成为一个极具代表性的案例。在理解酶结构-功能关系的基础上，通过对酶活性 中心的改造，将为未来蛋白质工程提供有效的指导。
[0163]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种DBAT突变酶D166HR363H，其特征在于：所述的DBAT突变酶D166HR363H是氨基酸 序列为SEQ ID N0:2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His，第363位氨基酸由Arg改变 为His;其氨基酸序列为SEQ ID N0:8。2. 编码权利要求1所述的DBAT突变酶D166HR363H的基因，其特征在于:其核苷酸序列为 SEQ ID N0:7。3. -种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的DBAT突变酶D166HR363H的重组质粒。4. 根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于:所述的重组质粒携带有权利要求2所 述的基因。5. -种工程菌株，其特征在于:所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。6. 根据权利要求5所述的工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株为TBL21-D166HR363H，其宿主菌为大肠杆菌BL21。7. 权利要求1所述的DBAT突变酶D166HR363H在催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰基 供体为乙酰辅酶A，所述的DBAT突变酶D166HR363H的催化效率比DBA!1酶提高了 39倍。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰基 供体为乙酸乙烯酯，所述的乙酸乙烯酯的利用率提高了 143倍。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰 基供体为乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯或乙酸异丙烯酯。
【专利摘要】本发明公开一种DBAT突变酶D166HR363H及其应用。该突变酶是氨基酸序列为SEQ？ID？NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp变为His，第363位氨基酸由Arg变为His；其氨基酸序列为SEQ？ID？NO：8。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了39倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本发明寻找了7种廉价的酰基供体，突变酶均能高效利用这些酰基供体，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了143倍，能作为替代昂贵的乙酰辅酶A用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。
【IPC分类】C12N9/10, C12P17/02, C12N1/21, C12N15/70, C12N15/54
【公开号】CN105524892
【申请号】CN201610028306
【发明人】林俊芳, 黄佳俊, 郭丽琼, 尤琳烽, 叶志伟
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月15日