半乳寡糖的生产的制作方法
【专利说明】半乳真糖的生产
[0001 ] 本发明设及用于制备半乳寡糖（galact〇-〇ligosaccha;ride，GOS)的方法。GOS (也 称为寡聚半乳糖基乳糖、寡聚半乳糖、寡聚乳糖或反式半乳寡糖 (付日113旨日1日(31:〇〇11旨〇3日。油日1'1(1日，1'05))是一种重要的食品成分[1]。由于605具有不可消化 性，因此其属于益生元组群(group of prebiotics)。益生元被定义为通过刺激结肠中有益 细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响的不易消化的食品成分。GOS当添加至婴儿配 方乳（infant mUk formula)时复制人乳之促双歧杆菌生长作用(bifidogenic effect)的 能力（不仅在细菌数量方面，而且对于结肠微生物丛的代谢活性也如此)已使对其生产W及 在多种食品和制药过程中应用的关注显著提高。例如，GOS存在于市售可得的产品中，例如 用于婴儿和成人两者的食品，范围从婴儿配制品到用于严重疾病的食品。
[0002] 顾名思义，GOS的合成通常设及多个由0-半乳糖巧酶（0-D-半乳糖水解酶；EC 3.2.1.23)催化的半乳糖基转移过程，0-半乳糖巧酶使用乳糖作为半乳糖基供体，使用乳糖 或中间体GOS物类作为半乳糖基接受体。
[0003] 潜在的机制示于方案1中。简言之，酶和半乳糖基供体(乳糖，e-D-Galp-(l ,4)-0-D-Glcp)初始形成瞬时半乳糖基-酶复合物化n--Galp)并随后形成真正的共价半乳糖基-酶 复合物化n-Galp)，其从该复合物释放葡萄糖分子(0-D-G1邱）。然后，另一半乳糖基接受体 (乳糖e-D-Galp-(l，4)-e-D-Glcp或其他GOS物类)与该复合物在活性中屯、结合并一般用其 非还原端(乳糖的半乳糖基部分)对该半乳糖基-酶复合物化n-Galp)进行亲核攻击，由此导 致形成DP3 GOS物类，其一般表达为e-D-Galp-( 1 一n)-e-D-Galp-( 1，4)-e-D-Glcp产物，其 中n表示糖巧键的位置，其根据酶来源和所应用的反应条件可W是2、3、4或6。
[0005] 方案1.通过0-半乳糖巧酶催化之乳糖通过0-1，4糖巧键的延伸的GOS合成机制的 示意图。
[0006] 随着反应的进行（参见方案1)，越来越多的半乳糖基部分被转移至现有的GOS物 类，导致形成具有不同聚合度（degree of polymerization,DP)的GOS物类。因此，GOS-般 可表达为(Gal)m-Glc(其中根据酶来源和所应用的反应条件，m通常在2至9之间变化）。除> DP3 GOS物类之外，新的DP2物类(例如异乳糖)通常被认为是0-半乳糖巧酶的半乳糖基转移 作用的初级产物。通过e-半乳糖巧酶的半乳糖基转移形成的运些新DP2物类可进一步参与 形成高等DP GOS物类，因而使GOS产物谱复杂化，如下文所讨论。
[0007] 尽管酶0-半乳糖巧酶在食品和乳制品工业中具有多种应用，但是酶的中度稳定性 是阻碍生物催化剂在工业规模上进行一般性实施的限制之一。探索其作为催化剂的全部潜 能的研究已产生多种用于酶稳定化的合适策略。例如，已通过多种方法(例如物理吸附、捕 获和共价结合方法)将酶固定在不同的支持物上。还已表明，固定化对降低e-半乳糖巧酶的 生产抑制具有有利作用。此外，酶固定化有利于酶的可重复使用性和GOS合成过程的持续操 作。
[0008] 众所周知，e-半乳糖巧酶催化的GOS合成在动力学上受到控制[2]。运意味着，在某 个时间点形成的半乳寡糖实际量在很大程度上取决于乳糖和/或GOS的期望合成反应相对 于不期望水解反应的相对速率。运进而不仅依赖于乳糖浓度而且还依赖于所形成的GOS物 类，并且再者还依赖于酶与由合成和水解产生的产物的相互作用。
[0009] 因此，多种GOS物类不仅可用作进一步GOS合成的接受体而且还可用作水解底物。 水解反应一般将在反应后期占优势，此时已经过GOS浓度的峰值并且反应混合物中主要底 物乳糖的浓度降低至较低值。另一方面，当积累越来越多的产物时还可发生生产抑制，导致 GOS合成或GOS水解被抑制。
[0010] 使用e-半乳糖巧酶来提高由乳糖合成GOS的产率的多种因素在本领域中是已知 的。有关GOS的生产、特性和应用的综述，参见Torres等。用于半乳糖基转移的反应条件应为 高乳糖浓度、高溫和反应介质中的低水活性。溫度、底物浓度和酶来源在寡糖的酶促合成中 发挥重要作用。然而，初始乳糖浓度的影响可大得多。关于使用高度浓缩的起始乳糖溶液， 已表明最大GOS产率在很大程度上主要受初始乳糖浓度的影响，直至浓度范围为30%至 40% (w/v)。一般来说，用越高的初始乳糖浓度可产生越多且越大的半乳寡糖(GOS)。由于乳 糖的溶解度在室溫下相对较低但随着溫度的升高明显提高，因此一般期望高溫。
[0011] 较高的溫度可有益于较高的寡糖产率。当在高初始乳糖浓度并因此在高溫下操作 时，高溫下的高产率是一个额外优势。另一方面，固定化e-半乳糖巧酶用于合成GOS的潜能 (例如通过高效再循环来降低酶的成本贡献、易于操作和控制过程W及实现持续过程)已得 到广泛认可。然而，固定化e-半乳糖巧酶用于生产GOS的工业用途尚未报道。化retia等的研 究实例中表明，当在重复分批操作下使用高酶剂量(约18%的乳糖(w/w))在50% (w/w)乳糖 溶液中于60°C下进行反应时，固定化环状芽抱杆菌(B.circulans)e-半乳糖巧酶是可再循 环的。
[0012] 因此，一般优选的是在高初始乳糖浓度的条件使用固定化酶来进行GOS合成W实 现高GOS产率并降低水解副反应[3，4，5 ]。
[0013] 然而，本发明人发现，从在研究环境中进行的优化研究获得的结果并不总是为工 业规模的GOS合成提供良好指示，例如在食品工业中，其中通常出于经济原因而使用相对低 的酶浓度(和/或较小量的固定化酶)和长（>20小时)解育时间W实现高生产率和高时空产 率（space-time yield)。特别地，他们观察到，在重复分批操作中在60°C下使用高度浓缩 (55%w/w)的乳糖溶液作为GOS合成的乳糖进料(feed)导致在第二个操作循环之后固定化 酶损失约95 %的初始活性LU。
[0014] 因此，他们开始着手开发用于在工业规模进行GOS合成的改进的反应条件，其允许 重复地再使用固定化酶同时保留相当的酶活性且不牺牲高GOS产率和成本有效性操作。
[0015] 令人惊奇地发现，上述目的可通过使用结晶乳糖的浆料(slurry)代替高度浓缩的 溶解乳糖溶液作为乳糖进料来实现。更具体地，当将55%w/w的乳糖浆料与固定化酶在58°C 下解育24小时时，在第S个反应循环之后保留20%的初始LU酶活性(如下文限定的作为LU 测量）。在初始的六个批次期间，最终的GOS含量高于60% (dm)。不期望受任何理论的限制， 推断:认为通过在高溫下完全溶解制备的常规高度浓缩乳糖溶液是"亚稳定"溶液，其在长 时间解育期间在较低反应溫度下将经历重结晶。运导致在酶载体的表面上和孔中形成乳糖 晶体，可能不仅导致可利用性降低而且还导致固定化酶失活(变性）。令人惊奇的是，运可通 过使用"预结晶"乳糖的混悬液而避免，其中乳糖晶体用作底物库并且溶解的乳糖可自由地 进入酶载体的孔中。因此，通过使用"预结晶"的乳糖可阻止酶变性且无需通过将结晶乳糖 预加热至较高溫度来使乳糖完全溶解，由此导致可持续的工业过程。
[0016] 因此，本发明提供了用于由乳糖制备半乳寡糖(GOS)的方法，其包括使乳糖进料与 e-半乳糖巧酶接触，所述e-半乳糖巧酶优选地被固定在固体载体上；W及允许进行GOS合 成，其中所述乳糖进料是结晶乳糖的水性浆料(aqueous slurry)。
[0017] 本文中使用的术语"水性浆料