稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物标记领域。更具体地说，本发明涉及一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备。
【背景技术】
[0002]1986年，有学者在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了一种有膜结构的小囊泡，被称之为外泌体。至1996年，有学者发现EB病毒转化的人B细胞内一些有膜结构的小囊泡表面可表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility comp I ex, MHC) Π类分子，能激活T细胞，并与红细胞内外泌体的形成过程和排出途径相似(参见Van Niel G,Porto-Carreiro I，Simoes S,Raposo G.Exosomes: a common pathway for aspecialized funct1n.J B1chem2006，140:13?21)，自此之后，人们开始对外泌体展开广泛的研究。外泌体是由活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的直径为30?120nm的膜性囊泡(参见Stoorvogel WjKlei jmeer MJ , Geuze HJ , Raposo G.Theb1genesis and funct1ns of exosomes.Traffic 2002，3:321 ?330)。目前的研究方向主要有干细胞、免疫、microRNA和靶向给药。2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，推动外泌体的研究达到全新的高度。
[0003]各种不同种类的细胞、组织、器官和系统相互协调、共同维持着我们复杂机体的正常运行(参见J.Skog，T.Wiirdinger，S.van RijnjD-H-MeijerjL-Gainche,M.Sena-Esteves,ff.T.Curry Jr.,B.S.Carter,A-M-KrichevskyjX-O-BreakefieldjGl1blastomamicrovesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth andprovide diagnostic b1markers,Nat.CelI B1l.2008，10:1470?1476) D这与细胞之间的信息传递是密切相关的，而细胞之间的信息传递，最主要是由细胞自己制造和释放的某些特定化学物质来实现的，例如外泌体。当机体处于不正常状态，例如疾病(癌症)发生时，就会释放一些信号物质来调节身体机能来适应变化。这时，外泌体作为这些信号物质中的一员，就起了非常大的作用(参见merican Cancer Society ,Global Cancer Facts&Figures ,2nd Edit1n American Cancer Society ,Atlanta，2011)。外泌体含有蛋白质，mRNA，miRNA等信号分子，它们反映分泌细胞的生理状态和功能状态，甚至还会包含细胞病态相关的分子信息，从而提供了丰富的潜在的生物标志物分子源(参见Yu SiCao HiShenB，Feng JTumor-derived exosomes in cancer progress1n and treatmentfailure.0ncotarget.2015,7:10?18)。关于外泌体作为生物标志物来研究细胞之间的信号传递已成为细胞生物学、分子生物学和医学领域的研究热点之一.细胞信号传递与肿瘤等多种疾病的发生、发展和预防直接相关(参见Simons MjRaposo GjExosomes-Vesicularcarriers for intercellular communicat1n.Curr Opin Cell B1l 2009,21:575?581)。因此，外泌体的研究将在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。
[0004]近红外焚光蛋白(Near-1nfraredfluorescent protein，iRFP)是绿色焚光蛋白同源的一类荧光蛋白，具备绿色荧光蛋白的发光优点(参见Mikhail BalobanjDariaM.Shcherbakova，Vladislav V.Verkhusha,Two-Color Imaging using SpectralVariants of iRFP670 and iRFP682Near_Infrared Fluorescent Proteins,B1physicalJournal，2015，108:624-631)。但是，相比于GFP，它的激发光和发射光波长更长，位于近红外光区(650?900nm)，在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记分子(参见Grigory S.Filonov,Vladislav V.Verkhusha1A Near-1nfrared BiFC Reporter for In Vivo Imaging ofProtein-Protein Interact1ns Original Research Article Chemistry&B1logy,2013，20:1078-1086)。近红外荧光蛋白丨1^?682的激发光和发射光波长分别为66311111和682nm，是单体荧光蛋白分子，其发光性质较为稳定，较长的光谱特点使其在活体动物组织成像的应用中更具潜力。
[0005]由此，若能将外泌体的独特功能和近红外荧光蛋白在体内体外示踪的优越性结合起来，将能为进一步研究细胞间物质转移机制提供有力工具。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0007]本发明还有一个目的是提供一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，其通过将编码近红外荧光蛋白iRFP682和外泌体CD63蛋白融合表达的基因整合至乳腺癌细胞基因组中，从而可获得稳定分泌近红外荧光标记的外泌体的乳腺癌细胞株，最终得到一个可用于乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标志物，为进一步研究细胞间物质转移机制提供了有力工具，同时也给癌症的诊断和治疗方案提供新的支持和契机。
[0008]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，其包括如下步骤:
[0009]I)编码外泌体标记蛋白⑶63基因的获得:
[0010]从人乳腺癌MDA-MB-231细胞中提取总RNA进行逆转录得到cDNA，用带XbaI和ClaI酶切位点，以及Linker序列的引物进行PCR扩增得到目的基因片段⑶63-Linker;
[0011]2)重组质粒载体的构建:
[0012]步骤I)得到的所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-1RFP682经T4DNA连接酶作用得到重组质粒载体 pAAV-CD63-Linker-1RFP682;
[0013]3)重组腺相关病毒的制备:
[0014]使用所述重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-1RFP682和辅助质粒体外共转染AAV-293细胞，包装重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682 ；
[0015]4)稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备:
[0016]使用所述重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682和辅助腺相关病毒共感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过荧光筛选获得稳定分泌近红外荧光蛋白标记的外泌体的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株；
[0017]5)近红外荧光标记人乳腺癌MDA-MB-231细胞的外泌体提取及鉴定
[0018]采用分步离心法从步骤4)标记成功的MDA-MB-231细胞培养上清液中提取iRFP682标记的外泌体并进行鉴定。
[0019]优选的是，其中，所述步骤5)中分步离心法的步骤为:
[0020]首先将所述细胞培养上清液在4°C条件下依次经2000g离心15min、5000g离心15min及12000g离心30min去除细胞碎片，得第一上清液；
[0021 ]其次将所述第一上清液使用孔径不大于0.2μπι的膜过滤后，于4°C、12000g条件下离心120min，得到外泌体粗沉淀；
[0022]最后用PBS溶液重悬所述外泌体粗沉淀，混合均匀后在4°C和12000g条件下离心90min，得到提纯外泌体，将所述提纯外泌体使用PBS溶液重悬后置于-80°C条件保存备用。
[0023]在外泌体的提纯过程中，外泌体为30?10nm的杯状膜结构囊泡，易受外界压力和温度影响，所以无论是提取过程还是解冻使用过程，都需控制温度在4 °C左右。解冻需要在冰上进行。此外为避免蛋白酶对外泌体的干扰，冻存前还应加入蛋白酶抑制剂，4°C可保存3周，-80 °C可保存2-3年。
[0024]优选的是，其中，所述步骤5)中iRFP682标记的外泌体鉴定的方法为:使用westernblot鉴定所述外泌体的膜表面蛋白，通过透射电镜观察所述外泌体结的构，以及通过S頂结构光照明超分辨焚光显微镜观察外泌体的焚光标记。
[0025]优选的是，其中，所述Linker序列为:ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg，既能保证近红外焚光蛋白 iRFP682 与外泌体表面标志CD63融合稳定的进行表达，又不会影响两者各自的生物学活性。
[0026]优选的是，其中，步骤3)的所述辅助质粒为pDG质粒，其中所述重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-1RFP682可提供AAV-293病毒所必须的ITR序列，辅助质粒pDG可提供AAV-293重组复制、包装病毒外壳等所必须的Rep和Cap基因，从而包装携带重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682。
[0027]优选的是，其中，所述辅助腺相关病毒为rAAVSVAV2，以提高外源基因的整合效率。
[0028]优选的是，其中，步骤2)所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-1RFP682的摩尔比例为2?5，以利于重组质粒载体的形成。
[0029]优选的是，其中，步骤4)所述所述重组腺相关病毒与所述人乳腺癌MDA-MB-231细胞数目的比例是3000?6000，以保证感染的效率。
[0030]本发明至少包括以下有益效果:
[0031 ]本发明制备的基因工程化乳腺癌细胞株能够稳定分泌近红外荧光蛋白iRFP682标记的外泌体，并通过分步离心的方法对近红外标记外泌体进行了有效的提纯，利用外泌体的独特功能及近红外荧光蛋白在体内体外示踪的优越性，可用做乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标记物，为进一步研究细胞间物质转移机制提供了有力工具，同时也在癌症的诊断和治疗方案中具有重要的应用价值。
[0032]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0033]图1为本发明制备得到的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的SM结构光照明超分辨荧光显微成像；
[0034]图2为本发明提纯后外泌体膜表面标志性蛋白的Westernblot检测图谱；
[0035]图3为本发明提纯外泌体的TEM高分辨透射电镜图；
[0036]图4为本发明提纯外泌体的S頂结构光照明超分辨荧光显微成像；
[0037]图5说明的是标记成功的MDA-MB-231细胞外泌体的分步离心提取过程。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0039]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“