创制光温敏不育系的方法及其在植物育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业和生物技术领域，尤其涉及一种创制光温敏不育系的方法及其在 植物育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 在农业生产中，由于传统去雄手段耗时费力，雄性不育系在杂交制种，提高农业 产量中有巨大的优势。雄性不育往往被分为细胞质雄性不育（CM巧W及细胞核雄性不育 (GM巧。H系杂交体系的建立依赖于细胞质雄性不育。然而，有几个缺点阻碍了H系配套杂 交在实践中的广泛应用。首先，细胞质雄性不育植株普遍存在着品质较差的的问题；其次， H系杂交水稻的组合增产潜力越来越小。再次，由于野败类型的雄性不育细胞质单一，一旦 胞质不育丧失或某种毁灭性病虫害发生，会造成巨大损失。随着细胞核雄性不育中光温敏 条件性雄性不育的发现，两系法杂交水稻应运而生。相对于H系杂交法，光温敏不育系兼有 不育系和保持系两种状态。与H系法相比，两系法具有不受恢保关系的限制，既核不育可W 与大量常规品种杂交，配组自由，因而更容易获得优良性状的杂交优势，从根本上解决H系 中雄性不育细胞质单一化的问题。近年来，两系杂交水稻在中国农业生产中的应用越来越 广泛。
[0003] 早在1973年，石明松在中国湖北省从晚梗品种（Oryza sativa ssp. japonica) 农呈58中选育出光敏感不育系并提出了一系两用的水稻杂种优势利用新途径。随后，W农 呈58S(NK58巧为父本，与釉稻杂交获得的培矮64S(PA64巧也在两系杂交中得到广泛应用。 但培矮64S的育性对于温度的变化更加敏感。在水稻中，光温敏不育系受到单基因隐性位 点控制。最近的研究表明，农呈58S与培矮64S的不育性状受到同一个遗传位点的控制，而 温度和光照都会对该位点产生影响，送些发现使人们对光温敏育性转换的分子机制更加难 W理解。
[0004] 目前为止，水稻中共有+ S个光温敏不育系被发现；pmsl, pms2, pms3, r pmsl, rpms2, tmsl, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6, rtmsl W 及 Ms-h,分另U 定位在第 7, 3, 12, 8, 9, 8, 7, 6, 2, 2, 5, 10和9条染色体上。光温敏不育在番茄，玉米W及小麦中也有 报道。最近的研究发现，一个突变的小3酷(3111曰111?酷)，〇3曰-31111?5864111,导致911132^及口/ tms2-l (农呈58S和培矮64巧突变体的不育表型。然而，光温敏不育的分子机理仍然不清 楚，使得人们缺乏有效的理论支持和技术手段来解决两系育种中实际问题。
[0005] 鉴于拟南芥较小的基因组，快速的生长周期W及大量的突变体库等无可比拟的优 势，使其在植物生物学研究领域成为模式植物。此外，拟南芥能够在严格控制温度，光照等 条件的狭小空间中进行培养。前人的研究发现了一些拟南芥条件不育突变体，如PEAMT基 因突变体t365 W及GA^AA生物合成受阻的ms33突变体都表现为温敏不育表型。
[0006] 然而，目前本领域中尚缺少调控方式简便的植物不育系用于植物育种过程中，因 此迫切需要调控方式简单方便的植物不育系培育技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种培育植物光温敏不育系的方法，包括降低花粉发育相关 的GD化醋酶表达或活性来创制光温敏植物材料，从而解决目前核不育光温敏遗传位点少， 制种纯度不高的问题。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种培育植物不育系的方法，包括步骤；降低所述植 物植株中花粉发育相关的GD化醋酶的表达或活性。
[0009] 在另一优选例中，所述的GD化醋酶参与所述植物的花粉发育过程的脂类代谢。
[0010] 在另一优选例中，所述的GD化醋酶将甘油H醋水解为甘油和脂肪酸。
[0011] 在另一优选例中，所述的"降低"是指将所述植株中在花粉发育过程中GD化醋酶 的表达活性降低满足W下条件：
[0012] A1/A0的比值《80 %，较佳地《60 %，更佳地《40 %，最佳地为0-30 % ;
[0013] 其中，Al为所述植株中花粉发育相关的GD化醋酶的酶活性；AO为野生型同种类型 植物植株中相同GD化醋酶的酶活性。
[0014] 在另一优选例中，所述GD化醋酶为TMFl或其同源蛋白。
[001引在另一优选例中，所述TMFl的野生型氨基酸序列选自下组；SEQ ID NO. : USEQ ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4、沈Q ID NO. :5 和沈Q ID NO. :6。
[0016] 在另一优选例中，所述GD化醋酶是选自下组的细胞、组织或器官中特异性表达 的：植物花序W及花药中。
[0017] 在另一优选例中，所述细胞或组织包括；绒租层、小抱子母细胞、或其组合。
[0018] 在另一优选例中，所述GD化醋酶在花药发育期特异性表达。
[0019] 在另一优选例中，所述的花药发育期包括前花药形成阶段（-3天~0天）、花药形 成阶段、后花药形成阶段（花药形成后1-5天）。
[0020] 在另一优选例中，所述GD化醋酶在花药发育第6期特异表达。
[0021] 在另一优选例中，所述GD化醋酶在花粉减数分裂期达到表达最高峰。
[0022] 在另一优选例中，所述降低植物植株中花粉发育相关的GD化醋酶活性的方法包 括：使GD化醋酶编码基因的表达水平下降、和/或使GD化醋酶活性下降。
[0023] 在另一优选例中，所述的下降指与野生型GD化醋酶的表达水平EO相比，所述植 株中花粉发育相关的GD化醋酶的表达水平El为野生型的0-80%，较佳地0-60 %，更佳地 0-40%;和/或与野生型的花粉发育相关的GD化醋酶的酶活性AO相比，所述植株中花粉发 育相关的GD化醋酶的酶活性Al为野生型的0-80 %，较佳地0-60 %，更佳地0-40 %。
[0024] 在另一优选例中，所述的降低植株中GD化醋酶活性通过选自下组的方式实现： 基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、或其组合。
[00巧]在另一优选例中，所述GD化醋酶编码基因为TMFl基因。
[0026] 在另一优选例中，所述TMFl基因能够编码沈Q ID NO. :1、沈Q ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4SEQ ID NO. :5 或沈Q ID NO. :6 所示氨基酸序列。
[0027] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：降低所述植株中TMFl基因的表达水平、缺 失TMFl基因和/或致TMFl基因突变来实现降低植株中GD化醋酶的表达或活性。
[0028] 在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、花弁；优选地包括禾本科，豆 科W及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高梁、小麦、大豆或拟南芥。
[0029] 在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科度rassicaceae)植物、鼠耳芥属 (Ar油idopsis)植物、拟南芥（A. thaliana)。
[0030] 本发明的第二方面，提供了一种花粉发育相关的GD化醋酶或其编码基因的用途， 用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。
[0031] 在另一优选例中，所述的编码基因为TMFl基因。
[0032] 在另一优选例中，所述TMFl基因能够编码沈Q ID NO. :1、沈Q ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4、沈Q ID NO. :5或沈Q ID NO. :6所示氨基酸序列。
[0033] 本发明的第H方面，提供了一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤；降低花 粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度。
[0034] 在另一优选例中，所述的植物是花粉发育相关的GD化醋酶的表达或活性水平下 降的植物。
[0035] 在另一优选例中，所述植物为根据权利要求1-6中任一项所述的方法培育的植物 不育系。
[0036] 在另一优选例中，所述方法包括；降低花粉细胞膜合成速度，从而延缓花粉发育。
[0037] 在另一优选例中，所述方法包括；降低植株代谢水平，从而降低花粉细胞膜合成速 度。
[0038] 在另一优选例中，所述降低或延缓是通过W下方式实现；降低植株生长的环境温 度、减少植株的光照时间、或组合。
[0039] 在另一优选例中，降低植株生长的环境温度包括将环境温度（平均温度）控制在 17-22°C，更优选地为 17-20°C，如 17°C、18°C、19°C或 20°C。
[0040] 在另一优选例中，降低植株生长的环境温度的时间包括花药形成阶段，花粉成熟 阶段W及开花授粉阶段，或其前后2周。
[0041] 在另一优选例中，在植株抽臺或抽穗时开始降低植株的生长温度，低温培育3-10 天后，恢复正常温度培育。
[0042] 本发明的第四方面，提供了一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤；将植 株由不育转为可育的步骤；和，维持植株可育并育种的步骤；
[0043] 在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据本发明第一方面的方法培育的植物 不育系进行维持；
[0044] 在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用根据本发明第H方面的方法将植 株由不育转为可育。
[0045] 本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞发育成的植株中花粉发 育相关的GD化醋酶的表达或活性降低。
[0046] 在另一优选例中，所述GD化醋酶为TMFl。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0048] 图1显示低温能够恢复雄性不育tmfl突变体的育性
[0049] a. Ler植株的正常可育表型。
[0050] b.在正常条件下，tmfl突变体的短小果芙不含种子。
[0051] C.低温条件下tmfl突变体植株完全恢复育性。
[00閲 d-f.比较野生型，tmfl (24 °C )和tmfl (17 °c )果芙的种子；野生型（d)和 tmfUUC ) (f)是有许多可育果芙，但是tmn(24t： ) (e)的短小果芙中没有种子。
[00閲 g-i.野生型和tmfl突变体花药的亚历山大染色。野生型（g)和tmfl (17°C ) (i) 花药中充满了紫色有活力的花粉，然而，在tmfl (24C)花药讯中只有绿色的残余表明花 粉败育。Bar = IOOum。
[0054] j. 17C不同持续时间处理下tmfl突变植株恢复可育果芙的数量。
[00巧]k.在不同温度处理下tmfl突变植株可育表型的变化，24C时果芙短小不育，在 17C处理时果芙恢复育性，将突变体重新置于24C时突变体又呈现不育表型。
[0056] 1.在不同植物生长阶段的低温处理，表明只有当生殖器官出现时突变体育性才能 被低温所恢复。
[0057] 图2显示tmfl突变体育性恢复的临界温度W及恢复时间
[0058] a. tmfl育性恢复的临界温度W及在不同温度下的tmfl可育恢复率；b.低温处理 后tmfl育性恢复的时间。
[0059] 图3显示恢复突变体花粉发育阶段的半薄切片分析
[0060] 野生型（a)和tmfl (24C )化）W及tmfl (17°c ) (C)花药的半薄切片。在第7期 花药中，野生型和tmfl (24C或17C )突变体花药没有可观察到的区别。在第8期，野生 型和tmfl (24°C或17°C)突变体药室中，小抱子成功的从四分体中释放。在第9期，在 tmfl (24C)中有些小抱子开始降解，然而在tmfl (17°C)中的小抱子与野生型的一致。在 第10期，大多数tmfl (24C)的小抱子细胞质皱缩且降解。然而，tmfl (17°C)中大部分恢 复的小抱子较为正常。在第11期，大多数tmfl (24C )的小抱子在药室中降解，而除了个别 败育的小抱子tmfl (17°C)中的花粉粒出现。在第12期，tmfl (17°C)中出现成熟花粉粒， 但是在tmfl (24C)仅有降解的细