序列的多 肤或多肤的片段、类似物和衍生物。此多核巧酸的变异体可W是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。送些核巧酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核巧酸的替换形式，它可能是一个或多个核巧酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肤的功能。
[0201] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核巧酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核巧酸可杂交的多核巧酸。在本发明中，"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1% SDS，6(TC ;或（2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v) 甲醜胺，0. 1 %小牛血清/0. 1% Ficol 1，42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90% W上，更好是95% W上时才发生杂交。并且，可杂交的多核巧酸编码的多肤与SEQ ID NO: 1-6所示的成熟多肤有相同的生物学功能和活性。
[0202] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至 少含15个核巧酸，较好是至少30个核巧酸，更好是至少50个核巧酸，最好是至少100个核 巧酸W上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（如PCR) W确定和/或分离编码GD化蛋白的 多聚核巧酸。
[0203] 本发明的GD化蛋白核巧酸全长序列或其片段通常可W用PCR扩增法、重组法或人 工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核巧酸序列，尤其是开放 阅读框序列来设计引物，并用市售的CDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的CDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩 增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0204] -旦获得了有关的序列，就可W用重组法来大批量地获得有关序列。送通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成 多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可W完全通过化学合成来 得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本 领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突 变引入本发明蛋白序列中。
[0205] 本发明也涉及包含本发明的多核巧酸的载体，W及用本发明的载体或GD化蛋白 编码序列经基因工程产生的宿主细胞，W及经重组技术产生本发明所述多肤的方法。通过 常规的重组DNA技术（Science, 1984 ;224 :1431)，可利用本发明的多聚核巧酸序列可用来 表达或生产重组的水稻GD化蛋白。一般来说有W下步骤；（1).用本发明的编码GD化蛋白 的多核巧酸（或变异体），或用含有该多核巧酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细 胞；（2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；（3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0206] 本发明中，GD化蛋白多核巧酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载 体"指本领域熟知的细菌质粒、瞻菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他 载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可W用。表达载体的一个重 要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0207] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GD化蛋白编码DNA序列和合适的转 录/翻译控制信号的表达载体。送些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组 技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，W指导mRNA合成。表 达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[020引此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，W提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氨叶酸还原酶、新霉素抗性W及绿色英光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨予青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列W及适当 启动子或者控制序列的载体，可W用于转化适当的宿主细胞，W使其能够表达蛋白质。宿主 细胞可W是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞， 如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
[0209] 本发明的多核巧酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用 于启动子W增强基因的转录。
[0210] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用 重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大 肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用化Clz法处理，所用的步骤 在本领域众所周知。另一种方法是使用MgClz。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磯酸巧共沉淀法，常规机械方法如显微注 射、电穿孔、脂质体包装等。
[0211] 转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植 物细胞、组织或器官可W用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变的植物。
[0212] 获得的转化子可W用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肤。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0213] 本发明的多核巧酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列（microarray)或 DNA芯片（又称为"基因芯片"）上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用GD化蛋白特 异的引物进行RNA-聚合酶链反应（RT-PCR)体外扩增也可检测GD化蛋白的转录产物。
[0214] 花粉发育
[0215] 植物中不同器官特异表达的脂酶基因也提示了其在植物发育中脂酶对调控脂质 代谢起到重要的作用度rick et al. 1995化et al.，2003)。作为水解酶的脂酶可催化切 去单个，双个和H个甘油W释放脂肪酸和醇类（An址awidjaja and Kanaya 2006)。酶活反 应提示了 TMFl拥有功能性的脂酶活性，从而通过脱脂作用来水解单个脂分子，在花粉发育 中，细胞膜的快速生长需要许多额外的原料补给包括游离脂肪酸W供膜合成使用我们推测 其可能参与到了小抱子细胞膜的脂类代谢当中，为细胞膜的合成提供脂分子原料。
[0216] 本发明的主要优点包括：
[0217] (a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的GD化醋酶的表达或活性来创制 植物不育系的方法。
[021引化）提供了一种通过降低花粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度来使不 育植株的性状转化为可育的方法。
[0219] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York = Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)或植物分子生物学-实验手册（Plant Molecular Biology-A Laboratory !annual, Melody S. Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分 比和重量份数。
[0220] 材料与方法
[0221] 植物材料与种植
[0222] 本发明中拟南芥材料为Lersberg erecta背景。EMS突变株的诱变和筛选参照 Zhang et al. 2007。4°C条件下，种子预萌发于0. 1 %琼脂糖培养基上72小时。植物材料培 养于歴石中，培养条件则为；室温24°C，光培养16小时/暗培养8小时（正常条件），直至 抽苔。之后，抽苔株转移至光照培养箱中低温培养（17°C -22C )。对于不同光周期，抽苔株 在室温24°C下，分别于光培养12小时/暗培养12小时；光培养10小时/暗培养14小时 或者是光培养8小时/暗培养16小时进行处理。
[0223] 原生质体分离与转染
[0224] 拟南芥原生质体分离和转染步骤可参考灯00 et al. 2007)。W野生型植株为模 板，克隆TMFl的全长CDNA片段（不包括终止密码子），用于GFP标签的融合。PCR产物克 隆至带有eGFP标签的PM0N530载体上，然后转染至新鲜分离的拟南芥原生质体中。转染后 的原生质体培养在23C黑暗条件下20个小时。最终，利用ZEISS共焦激光扫描显微镜进行 观察（Xsm 5PASCAL ;ZEISS, ht1:p://www. zeiss. com)。
[0225] 细胞学分析
[0226] 用尼康数码相机值-7000)拍摄植物材料。亚历山大染色与DAPI染色可参考Alex 和er, 1969;Ross et al.,1996。对于半薄切片，选取花巷不同发育阶段进行固定并包埋 于Spurr环氧树脂中（具体方法可参考Zhang et日1.,2007)。使用F*owe;rtome XL(RMC Pro化cts,化cson, Arizona, USA)切片机进行每Iym切片并用甲苯胺藍进行染色。使用 Olympus DX51数码相机（Olympus, Japan)进行花药切片的拍摄。将Snm金颗粒包裹新鲜雄 蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用JSM-840显微镜CJE化，Japan)观察。对于透射 电镜实验，将拟南芥花絮冰上固定于固定液中（配方是；含有2. 5 %戊二醒的0.1 M磯酸缓 冲液，pH 7. 2)。花巷材料则进一步依次包埋至树脂（'Hard Plus'Embedding Resin, Unite Kingdom)中（具体方法可参考Zhang et al.，2007)。超薄切片巧0-70nm)则利用JEM-1230 透射电子显微镜Cje化,Japan)进行观察。
[0227] RNA抽提和定量RT-PCR
[022引总RNA可利用Trizol试剂（Invitrogen，USA)由成熟±培拟南芥植物花组织 进行提取。利用poly-dT(12 - 18)引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5y g的RNA反转 第一条CDNA链（60分钟，42°C )。合成好的CDNA链作为PCR的模板。定量RT-PCR则是 利用 SYBR Green I master mix(Toyobo, Japan)通过 ABI PRISM 7300 系统（Applied Biosystems，USA)进行检测。定量RT-PCR的程序参数是；95°C 5分钟，94°C 10砂变性 40个循环，6(TC退货延伸1分钟。定量RT-PCR中所使用的引物列表于电子版的附件中。 目-Tubulin则作为对照。
[0229] 原位杂交
[0230] 根据digoxigenin (DIG) RNA标记试剂盒和PCR DIG引物合成试剂盒（Roche)说明 书进行非放射性RNA原位杂交实验。利用TMFl特异引物扩增CDNA片段。PCR产物克隆至 pSK载体并测序（Stratagene)。质粒DNA完全由HindIII和BamHI进行彻底消化，并W此 作为模板利用T3或是T7RNA聚合酶分别进行转录。利用Olympus DP70数码相机进行图片 拍摄。
[0231] 植物内源性酶活实验
[0232] 利用植物蛋白提取试剂（Thermo Scientific P;rod#89803, USA)将不同光周期和 温度下花巷组织的蛋白进行提取。无色底物p-nitro地enol butyrate(p-NPB)溶解于20mM 的异丙醇中。按1:10轻摇稀释地OS地ate-化iton X-IOO缓冲液，直至溶液澄清并达到稳 定乳状液。混合液巧Oul)分配至比色皿中，且分别在24C和17C预赔育15分钟。含有植 物总蛋白（〇.〇8ug/ul，50ul)的