一种菰黑粉菌单倍体菌株uemt2及其应用
【专利摘要】一种菰黑粉菌单倍体菌株UEMT2及其应用，属于生物技术领域。本发明中菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT2，保藏号为：CGMCC No.11841。茭白人工育种需要两种性亲和单倍体菌株的共同侵染，该菌株可以作为茭白人工育种的母体菌株并通过筛选得到其性亲和的单倍体菌株后，通过人工接种方法即可以实现人工孕茭。同时该单倍体菌株可以进行基因工程改造从而为接下来的茭白品种改良，如提高茭白的环境适应性、控制结茭时间等茭白育种工作提供实施基础材料。CGMCC No.1184120151207
【专利说明】
一种菰黑粉菌单倍体菌株UEMT2及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菰黑粉菌单倍体菌株UEMT2及其应用。
【背景技术】
[0002]菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是该专一性寄生的菰黑粉菌与茭白植株互相作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大，而且菰黑粉菌存在多个生理小种，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品种性状不稳定，退化明显。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。
[0003]研究表明菰黑粉菌的两个性亲和单倍体混合接种可以使正常开花的野茭植株孕茭，即植株茎基部发生膨大并且不再抽穗开花，而非性亲和单倍体菌株混合、双核菌丝或冬孢子接种均无法使野茭植株孕茭(近源的玉米瘤黑粉菌研究进展亦表明黑粉菌的侵染需要两个性亲和单倍体一起混合接种)，因此，菰黑粉菌性亲和单倍体的获得是保障茭白人工育种的前提。而自然界中菰黑粉菌以二倍体冬孢子或者双核菌丝存在，没有单倍体菌株。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种菰黑粉菌单倍体菌株UEMT2及其应用的技术方案。
[0005]本发明提供的一种菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)单倍体菌株UEMT2能够促使菱白人工孕茭和茭白品种改良。该菌株于2015年12月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC N0.11841。保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。该菌株具有以下性质:
形态特征:短杆状，成熟的孢子在20-25微米左右，单核无隔膜，进行芽殖(图2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0006]培养特性:固体培养(YEPS固体培养基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂糖)菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养(YEPS液体培养基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如细菌菌液。
[0007]生理代谢特性:该菌株偏好复合碳源(图4)和复合氮源(图5)作为其生长的碳氮源，对有机碳源的喜好大于无机碳源，对乳糖和半乳糖的耐受性较差，对氨基酸的喜好程度大于无机氮源。
[0008]培养方法:可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则易造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。
[0009]繁殖方法:芽殖。
[0010]本发明的有益效果:茭白人工育种需要两种性亲和单倍体菌株的共同侵染，该菌株可以作为茭白人工育种的母体菌株并通过筛选得到其性亲和的单倍体菌株后，通过人工接种方法即可以实现人工孕茭。同时该单倍体菌株可以进行基因工程改造从而为接下来的茭白品种改良，如提高茭白的环境适应性、控制结茭时间等茭白育种工作提供实施基础材料。
【附图说明】
[0011]图1为UEMT2单倍体菌株获得途径示意图；
图2为核定位EGFP蛋白过表达的单倍体菌株芽殖形态图；
图3为单倍体菌株固体培养形态图；
图4为单倍体菌株在不同碳源培养基中的生长速率变化图；
图5为单倍体菌株在不同氮源培养基中的生长速率变化图；
图6为野茭植株人工接种菰黑粉菌后孕茭过程中茭白植株茎尖组织切片荧光显微观察图，其中左边图为接种液中含有UEMT2菌株，右边图为接种液中不含UEMT2菌株；
图7为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0013]实施例1:菌株筛选鉴定方法
I.收集冬孢子:从龙茭2号正常茭中(图1A)直接挑取冬孢子。
[0014]2.冬孢子悬液:将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经4层灭菌纱布过滤，获得较纯的冬孢子悬液，最后再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为13个孢子/mL。冬孢子形态如图1B所示。
[0015]3.冬孢子培养:取100 yL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28°C培养约60h，以肉眼可见细小分散的单菌落(图1C)为标准。担孢子分离培养基(I L)配方为= K2HPO4 Ig,MgSO4.7H20 0.5 g,FeSO4.7H20 0.01g，KCl 0.5 g，葡萄糖 18 g, (NH4)2SO4 5.28 g，琼脂10 go
[0016]4.单孢分离培养:挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成13个孢子/mL，每次取I yL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子(图1D)，将分离出的担孢子在YEPS(2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂粉)固体培养基上，28 0C培养4 d。一个单菌落分离5个担孢子，取3个以上单菌落。担孢子培养后的菌落形态如图1E所示。
[0017]5.显微观察:对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑(图1Π则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝(图1G)，则舍弃。
[0018]6.性亲和菌株筛选:将初步鉴定的单倍体菌株编号(图1E)，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD6qq为2.0的菌液。通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定。融合反应实验如图1H，具体过程为:将I号菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点I uL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数。之后将剩余的各菌液各取I HL分别覆盖于I号菌株菌点上方，标记菌株号，于28°C培养箱中培养4 d。培养后对菌落形态进行肉眼观察，若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株。如图1H中所示，I号菌株与
2、3、4、8或11号菌株可能为性亲和单倍体菌株。
[0019]7.PCR鉴定:通过对菰黑粉菌交配型位点的克隆分析，发现菰黑粉菌中存在3个信息素受体pra基因，分别为pral、pra2和pra3，pral的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。众所周知，一个单倍体菌株中只可能存在一个pra基因，而两个性亲和的单倍体菌株中pra基因不一样。因此设计特异性引物用于进一步对筛选得到的单倍体进行PCR验证，并进一步确认彼此间的性亲和性。
[0020]以上述筛选到的12个单倍体菌株为例，提取各菌株的DNA，先通过引物ITSl和ITS4扩增ITS序列并测序进行菌种鉴定，PCR结果如图7D所示，测序结果经NCBI比对后表明均属于Ustilago esculenta。
[0021]接下来对各个菌株基因组DNA中的pral、pra2和pra3进行PCR扩增，结果如图7A，B，C所示，表明2、4号菌株的信息素受体基因为pra3，3、8、ll号菌株的信息素受体基因为pral，其余菌株的信息素受体基因为pra2，即我们筛选得到的菌株I信息素受体基因为pra2，与2、
3、4、8或11号菌株的基因型不一样，因此I号菌株与2、3、4、8或11号菌株为性亲和单倍体菌株。PCR扩增反应体系为:10XPCR缓冲液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物I yL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加(IdH2O至50 yl^PCR扩增程序为94 °C 4 min；94 °C 30 s，55°C 30 s，72 °C 2 min，30个循环；72 V 10 min；4 °C终止，扩增片段长度均在600 bp上下，引物序列如下:
ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)， ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)， pral-F:5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示)， pral-R:5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示)， pra2-F:5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示)， pra2-R:5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示)， pra3-F:5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示)， pra3-R:5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示)。
[0022]8.确定单倍体菌株:当采用引物pra2-F和pra2-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株确定为单倍体菌株UEMT2。
[0023]该单倍体菌株UEMT2具有以下性质:
形态特征:短杆状，成熟的孢子在20-25微米左右，单核无隔膜，进行芽殖(图2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0024]培养特性:固体培养(YEPS固体培养基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂糖)菌落呈乳黄色，表明光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落，如图2所示。液体培养(YEPS液体培养基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如细菌菌液。
[0025]生理代谢特性:该菌株偏好复合碳源(图4)和复合氮源(图5)作为其生长的碳氮源，对有机碳源的喜好大于无机碳源，对乳糖和半乳糖的耐受性较差，对氨基酸的喜好程度大于无机氮源。
[0026]培养方法:可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则易造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。
[0027]繁殖方法:芽殖。
[0028]实施例2:人工孕茭试验
通过PEG介导的原生质体转化技术将过表达EGFP绿色荧光蛋白的载体转化菰黑粉菌(Ustilago esculenta)单倍体菌株UEMT2及其性亲和菌株(选取实施例1中的2号、3号)，使其过表达EGFP绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜可检测获得的过表达菌株，成功过表达EGFP绿色荧光蛋白的菌株可在荧光显微镜下看到绿色荧光信号，如图2所示。而后进行人工接种实验，具体人工接种过程如下:
1)将两个菰黑粉菌性亲和单倍体菌株在YEPS液体培养基中28°C摇菌至OD6qq为1.0，离心收集菌体，用0.5 X YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD6qq为3.0的菌液，将两菌液混合用于接菌；
2)将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，25°C温室培养20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；
3)将步骤I)得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；
4)将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，25°C温室放置12 h;
5)将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，25°C温室培养7 d，完成接种；
6)将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。
[0029]结果我们发现该菌株与其性亲和菌株2号一起侵染野生茭白植株可以使野生茭白植株茎基部膨大形成茭白，而2号和3号性亲和菌株混合(即缺失菌株UEMT2后)野生茭白植株茎基部不再膨大，即无法孕茭。对接种后两种表型的茭白植株茎尖生长点取样，进行组织切片后在荧光显微镜下观察发现:茎基部膨大的植株中可以明显观察到带有绿色荧光的菌丝，而未膨大的植株茎尖无绿色荧光信号(图6)，表明该孕茭过程需要UEMT2的参与，即单倍体菌株UEMT2可应用于人工孕茭。
【主权项】
1.一种菰黑粉菌(UstiIago 68(:11161^3)单倍体菌株1^]\^2，保藏号为:CGMCCN0.11841。2.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)单倍体菌株UEMT2在菱白人工孕茭中的应用。3.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)单倍体菌株UEMT2在菱白品种改良中的应用。
【文档编号】A01H1/00GK105838618SQ201610058049
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年1月28日
【发明人】叶子弘, 俞晓平, 张雅芬, 崔海峰
【申请人】中国计量学院