一种荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种FAdV?4TaqMan MGB的荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用，包括1对特异性引物对和1条荧光探针；特异性引物对的核苷酸序列SEQ ID NO.1～2，荧光探针的核苷酸序列SEQ ID NO.3。本发明的禽腺病毒Ι亚群C种第4血清型病毒(FAdV?4)TaqMan MGB荧光定量PCR检测引物和探针，以及基于所述引物和探针建立FQ?PCR检测方法具有快速、特异、敏感、高通量等优点，可在1～2h内完成检测，能满足大批量、快速检测禽腺病毒Ι亚群C种第4血清型病毒的要求；为禽腺病毒的快速检测、传染源调查、传播环境、病原追溯提供了有效工具，对该病的防控具有重要意义。
【专利说明】
一种荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，尤其涉及一种禽腺病毒血清4型(FAdV-4)TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 禽腺病毒分为I亚群、Π 亚群、ΙΠ 亚群禽腺病毒。I亚群(Fowl adenovirus groupl， FAdVI)是从鸡、火鸡、鹅和鹌鹑的呼吸道分离出来到病毒，该亚群病毒又分为A、B、C、D、E 5 个种共12个血清型，各个血清型的病毒之间不能产生交叉保护。在过去的很多年里FAdVI较 多的是在体内复制而不发病，动物感染该病毒后，呈隐性感染，与其他病原共同作用于家 禽。但自2015年以来，在北京、山东、河南等地发生的以心包积液、包涵体肝炎、肾炎、呼吸道 症状等为特征的I亚群C种中的第4血清型(FAdV-4)禽腺病毒感染，给我国的养禽业造成了 严重经济损失。该病在不同品种不同日龄的鸡群中均可发生，发病率50%，死亡率达20~ 80%。因此，对FAdV-4进行快速准确的检测，可为该病综合防控措施的制定和流行病学研究 提供有价值的信息。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用，旨在在 临床中快速、准确检测FAdV-4病毒，为该病综合防控措施的制定和流行病学研究提供有价 值的信息。
[0004] 本发明是这样实现的，一种FAdV-4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂，所述FAdV-4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂包括1对特异性引物对和1条荧光探针；
[0005] 所述特异性引物对的核苷酸序列SEQ ID NO. 1~2,荧光探针的核苷酸序列SEQ ID Ν0·3〇
[0006] 进一步，所述FAdV-4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂还包括:DNA裂解液、荧光定 量反应液、阴性模板、阳性模板；
[0007] 所述阴性模板为正常SPF鸡胚毛尿囊膜DNA，所述阳性模板为灭活FAdV-4鸡胚绒毛 尿囊膜病毒DNA。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种所述FAdV-4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂的 制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0009] 步骤一，筛选出FAdV-4六邻体蛋白基因高度保守且具有FAdV-4型特异性基因序 列，设计检测FAdV-4六邻体蛋白基因的1对特异性引物对和1个TaqMan MGB探针，分别命名 为FAdV-F(Pl)、FAdV-R(P2)和FAdV-MGB-FAM-探针(Probe-P3);
[0010] 步骤二，模板DNA的制备：以灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒为阳性对照，以正 常SPF鸡胚尿囊膜为阴性对照，与含有FAdV-4的拭子、气管、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、心包积 液等待检样品提取总DNA;
[0011] 步骤三，采用Trizol法提取总RNA;
[0012] 步骤四，反转录，每管反转录反应体系含如下成份:5 X M-MLV缓冲液4yL; 2.5mmol/ L dNTPs4yL;M-MLV反转录酶Ο · 5yL;RNA酶抑制剂Ο · 5yL;随机引物lyL;总体积10yL;
[0013] 步骤五，pGEM-FAdV-4标准品的制备，将含有FAdV-4六邻体蛋白基因的阳性扩增产 物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒采用T7和SP6引物进行测序；
[0014] 步骤六，优化的25yL PCR反应体系中，FAdV-4上、下游引物P1/P2终浓度分别为0.4 μL?〇 1 /L、0 · 5μL?。1 /L，Probe-P3终浓度为0 · 6μL?。1 /L，2 · 5mm。1 /L，dNTPs 2yL，10 X Ex Taq酶缓 冲液2.5yL，5U/yL Ex Taq DNA聚合酶0.25以1^，1.0\104拷贝/^的质粒模板各2以1^，去离子 水补足至总体积25yL;PCR反应程序为:94°C，5min; 94°C 15s，60°C30s，40个循环；
[0015] 步骤七，将获得的pGEM-FAdV-4阳性重组质粒进行10倍系列稀释，质粒终浓度调整 为1.0 X 107~1.0 X 10°拷贝AiL，共8个稀释度，以灭菌双蒸水为阴性对照，按优化的FQ-PCR 反应条件进行FAdV-4FQ-PCR敏感性试验，分别以pGEM-FAdV-4阳性重组质粒起始模板浓度 为X轴，以FQ-PCR循环次数C t值为Y轴作回归曲线，建立FQ-PCR方法的标准曲线。
[0016] 进一步，所述提取总DNA具体操作如下：分别取灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病 毒、阴性对照及待检样品各1 〇 〇 μ L于1.5 m 1离心管中，加入5 0 0 μ L消化液：含终浓度10 m Μ Tris-HCl、pH 8.0,终浓度25mM EDTA、pH 8.0,重量体积比终浓度0.5%SDS、终浓度 100mM NaCl，然后和10yL终浓度20mg/mL蛋白酶K混匀；置55°C水浴30min~lh，加入500yL Tris平 衡酚/氯仿/异戊醇，体积比为25:24:1混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经一20°C 预冷的异丙醇沉淀DNA，用质量百分比75 %乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20yL TE缓冲液溶 解沉淀，一 20 °C冻存备用。
[0017] 进一步，所述采用Trizol法提取总RNA具体操作如下：分别取待检样品各200yL于 1.5ml离心管中，再加入600yL的Trizol于祸旋器震荡2~3min，加入200yL氯仿，离心后，取 上清转入另1.5ml离心管中，加200yL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最 后用20yL DEPC水溶解沉淀，取10yL用于反转录，其余一20°C保存。
[0018] 进一步，所述测序正确的六邻体蛋白基因阳性重组质粒应用分光光度计测定其 0D26q和0D28q值及0D 26q/0D28()值，共重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-FAdV-4 质粒DNA溶液的浓度为8.02 X 101Q拷贝AxL，定量稀释至1.0 X 10°~1.0 X 101Q拷贝AxL，一20 °C保存备用。
[0019] 进一步，所述优化的PCR反应程序为：94°C，5min; 94°C 15s，60°C30s，40个循环。
[0020] 进一步，所述由敏感性检测结果建立的标准曲线，相关系数R2为0.998,斜率为-2.802，截距为33.721，从而得出拷贝数X与Ct值之间的线性关系表达式:y = -2.8021ogX+ 33.721ο
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种所述FAdV_4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂的 检测方法，所述检测方法包括:采用1对特异性引物对和1条TaqMan MGB荧光探针对样品模 板进行荧光定量PCR检测;所述1对特异性引物对的核苷酸序列SEQ ID NO. 1~2,1条荧光探 针的核苷酸序列SEQ ID N0.3;在阴性、阳性结果成立的条件下，若样品中检测到FAdV-4基 因阳性，则样品中存在FAdV-4核酸;反之则为阴性。
[0022]进一步，在阴性、阳性结果成立的条件下，根据Ct值和荧光强度判断结果。
[0023] 本发明提供的FAdV_4TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂和方法，是在GenBank中筛 选出FAdV-4六邻体蛋白基因高度保守且具有FAdV-4型特异性基因序列为扩增靶区域，设计 检测FAdV-4六邻体蛋白基因的1对特异性引物对和1个TaqMan MGB探针，采用实时荧光定量 PCR技术，实现对禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)的快速、准确检测。本发明提供 的检测试剂适用于疑似禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)感染家禽的拭子、气管、 心脏、肝脏、肾脏、脾脏、心包积液等的病毒核酸检测，灵敏度可达1.ΟΧΙΟ 1拷贝/VL，同易与 其混合感染或感染症状相似的其他病原体例如禽腺病毒I亚群中其他11个血清型病毒 (FAdV-Ι~3、FAdV-5~12)、减蛋综合征病毒(EDSV-76)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、新城 疫病毒（NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病毒（IBDV)传染性贫血因子 (CIV)、禽白血病病毒(ALV)等之间无交叉反应。
[0024] 本发明提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV_4)TaqMan MGB荧光定量 PCR检测引物和探针，以及基于所述引物和探针建立FQ-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、 高通量等优点，可在1~2h内完成检测，能满足大批量、快速检测禽腺病毒I亚群C种第4血清 型病毒的要求。为禽腺病毒病传染源调查、传播环境、病原追溯提供了有效工具，对该病的 防控具有重要意义。
【附图说明】
[0025]图1是本发明实施例提供的荧光定量PCR检测试剂制备方法流程图。
[0026]图2是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒（FAdV_4)TaqMan MGB荧光定量PCR方法建立扩增曲线；
[0027]其中，1为灭活FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒核酸扩增曲线;2~3为阴性对照扩增曲 线。
[0028]图3是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR方 法敏感性扩增曲线；
[0029] 1 ~9分别对应的质粒浓度为1·0Χ108、1·0Χ107、1·0Χ106、1·0Χ10 5、1·0Χ104、 1 ·0 X 103、1 ·0 X 102、1 ·0 X 101、1 ·0 X 10°拷贝AiL; 10为阴性对照。
[0030] 图4是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR方 法标准曲线。
[0031] 图5是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR方 法检测其他病原特异性扩增曲线；
[0032]其中，1为灭活FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒核酸扩增曲线；2~18为禽腺病毒I亚群 中其他11个血清型病毒(FAdV-Ι~-3、FAdV-5~-12)、减蛋综合征病毒(EDSV-76)、H9亚型禽 流感病毒(AIV H9)、新城疫病毒（NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病毒 (IBDV)传染性贫血因子(CIV)、禽白血病病毒(ALV)等病毒核酸扩增曲线；19为阴性对照。 [0033]图6是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR方 法重复性和稳定性试验结果图；
[0034] 1~3，4~6，7~9，10~12分别对应的阳性重组质粒浓度为1 · 0 X 106、1 · 0 X 105、1 · 0 X 104、1.0 X 10°拷贝ΛΛ的扩增曲线。
[0035]图7是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR方 法对47份疑似样品检测结果图；
[0036] P为阳性对照扩增曲线，8~10、16、18、20、32~38、41、42、45、47为?厶(^-4检测阳 性，其余样品为阴性，N为阴性对照。
[0037]图8是本发明实施例提供的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV_4)PCR方法对 47份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0038] P为阳性对照，N为阴性对照，9~10、16、18、20、32~38、42、45、47基因检测阳性，其 余样品为阴性。
【具体实施方式】
[0039]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0040] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0041] 如图1所示，本发明实施例的荧光定量PCR检测试剂的制备方法包括以下步骤：
[0042] S101:筛选出FAdV-4六邻体蛋白基因高度保守且具有FAdV-4型特异性基因序列， 设计检测FAdV-4六邻体蛋白基因的1对特异性引物对和1个TaqMan MGB探针，分别命名为 FAdV-4-F(Pl)、FAdV-4-R(P2)和FAdV-4-MGB-FAM-探针(Probe P3);
[0043] S102:模板DNA的制备：以灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒为阳性对照，以正常 SPF鸡胚尿囊膜为阴性对照，与含有FAdV-4的拭子、气管、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、心包积液 等待检样品提取总DNA;
[0044] S103:采用 Trizol 法提取总 RNA;
[0045] S104:反转录，每管反转录反应体系含如下成份:5XM-MLV缓冲液4yL;2.5mmol/L dNTPs (三磷酸脱氧核苷酸)4yL; M-MLV反转录酶0.5yL; RNA酶抑制剂0.5yL;随机引物lyL;总 体积l〇yL;
[0046] S105: pGEM-FAdV-4标准品的制备，将含有FAdV-4六邻体蛋白基因的阳性扩增产物 分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7 和SP6引物进行测序；
[0047] S106:优化的25yL PCR反应体系中，FAdV-4上、下游引物P1/P2终浓度分别为0.4μ mol/L、0 · 5ymol/L，Probe-P3终浓度为0 · 6ymol/L，2 · 5mmol/L，dNTPs 2yL，10 XEx Taq酶缓 冲液2.5yL，5U/yL Ex Taq DNA聚合酶0.25以1^，1.0\104拷贝/^的质粒模板各2以1^，去离子 水补足至总体积25yL。优化的PCR反应程序为 :94°(：，5!1^11;94°(：158,601€308,40个循环 ； [0048] S107:将获得的pGEM-FAdV-4阳性重组质粒进行10倍系列稀释，质粒终浓度调整为 1.0 X 107~1.0 X 10Q拷贝AiL，共8个稀释度，以灭菌双蒸水为阴性对照，按优化的FQ-PCR反 应条件进行FAdV-4FQ-PCR敏感性试验，分别以pGEM-FAdV-4阳性重组质粒起始模板浓度为X 轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立FQ-PCR方法的标准曲线。
[0049] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细的描述。
[0050] 实施例1，用于禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)TaqMan MGB荧光定量 PCR( FQ-PCR)检测的引物和探针以及检测方法的建立
[0051 ] 1 · 1材料
[0052] 1.1.1毒株
[0053]经灭活的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)，由河南省动物疫病预防控 制中心分离鉴定；禽腺病毒I亚群中其他11个血清型病毒(FAdV-1~3、FAdV-5~12)购自中 国兽医药品监察所;其他对照病毒、细菌或阳性重组质粒由河南省动物疫病预防控制中心 提供。
[0054] 1.1.2仪器和试剂
[0055] 荧光PCR仪，美国ABI公司产品，型号ABI ViiA 7;PCR扩增仪，德国Biometra公司产 品;凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东 联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等均购自宝生物工程（大连)有限公司，M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体等购自Promega公司。
[0056] 1.2方法
[0057] 1.2.1引物设计与合成
[0058] 经大量比对GenBank中I亚群禽腺病毒的12个血清型六邻体蛋白基因的DNA序列， 筛选出FAdV-4六邻体蛋白基因高度保守且具有FAdV-4型特异性基因序列，设计检测FAdV-4 六邻体蛋白基因的1对特异性引物对和1个TaqMan MGB探针，分别命名为FAdV-4-F(P1)、 FAdV-R(P2)和FAdV-4-MGB-FAM-探针(Probe P3)，所设计的引物和探针序列如下：
[0059] 检测引物和探针：
[0060] SEQ ID N0:l，Pl:5，-GCGCAAAGACCCCAACAT-3，
[0061] SEQ ID N0:2，P2:5，-GGCGCGCAGGTCGTT-3'
[0062] SEQ ID NO:3，Probe-P3:5'-FAM-ATCCTCCAATCCAGTCTG-MGB-3'；
[0063] 1.2.2模板DNA的制备：以灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒为阳性对照，以正常 SPF鸡胚尿囊膜为阴性对照，与含有FAdV-4的拭子、气管、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、心包积液 等待检样品提取总DNA，具体操作如下：分别取灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒、阴性对 照及待检样品各l〇〇yL于1.5ml离心管中，加入500yL消化液:含终浓度10mM Tris-HCl、pH 8.0,终浓度25mM EDTA、pH 8.0,重量体积比终浓度0.5%SDS、终浓度100mM NaCl，然后和10 μ?冬浓度20mg/mL蛋白酶K混匀；置55°C水浴30min~lh，加入500yL Tris平衡酚/氯仿/异戊 醇，体积比为25:24:1混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经一 20°C预冷的异丙醇沉 淀DNA，用质量百分比75 %乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20yL TE缓冲液溶解沉淀，一 20 °C 冻存备用。
[0064] 1.2.3总1?熟的制备
[0065]采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下:分别取待检样品各200yL于1.5ml离心管 中，再加入600yL的Trizol于祸旋器震荡2~3min，加入200yL氯仿，离心后，取上清转入另 1.5ml离心管中，加200yL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20yL DEPC(焦磷酸二乙酯)水溶解沉淀，取10yL用于反转录，其余一20°C保存。
[0066] 1.2.4反转录
[0067] 每管反转录反应体系含如下成份:5XM-MLV缓冲液4yL;2.5mmol/L dNTPs(三磷酸 脱氧核苷酸)4yL ;M-MLV反转录酶0.5yL; RNA酶抑制剂0.5yL;随机引物lyL;总体积10yL。向 每管反转录反应体系中加入步骤1.2.3所制得的RNA 10yL，37 °C水浴lh或置于PCR仪中37 °C 反应lh，反应结束后，70°C，15min灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或一20°C冻存备 用。
[0068] 1 · 2 · 5pGEM-FAdV-4 标准品的制备
[0069] 将含有FAdV-4六邻体蛋白基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中， 筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的 六邻体蛋白基因阳性重组质粒(命名为pGEM-FAdV-4)应用分光光度计测定其0D 26Q和OD280值 及0D26Q/0D28Q值，共重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-FAdV-4质粒DNA溶液 的浓度为8.02 X 101Q拷贝ΛΛ，定量稀释至1.0 X 10Q~1.0 X 101Q拷贝ΛΛ，一20°C保存备用。
[0070] 1.2.6FQ-PCR反应条件的优化
[0071] (1)将步骤1.2.5中获得的pGEM-FAdV-4重组质粒分别稀释至终浓度1.0 X 104拷 贝/yL作为检测模板，P1 /P2引物对分别稀释至终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8和1.(^111〇1/1，？1(^6-?3探针稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8和1.(^111〇1/1，应用荧光?0?仪(美国八81公司，型号481￥丑）采用矩阵法筛选不同 浓度的pGEM-FAdV-4引物和探针组合，筛选针对FAdV-4FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最 佳反应条件。
[0072] (2)优化的25yL PCR反应体系中，FAdV-4上、下游引物P1/P2终浓度分别为0.4μ mol/L、0 · 5ymol/L，Probe-P3终浓度为0 · 6ymol/L，2 · 5mmol/L，dNTPs 2yL，10 XEx Taq酶缓 冲液2.5yL，5U/yL Ex Taq DNA聚合酶0.25以1^，1.0\104拷贝/^的质粒模板各2以1^，去离子 水补足至总体积25yL。优化的PCR反应程序为：94°C，5min; 94°C 15s，60 °C30s，40个循环（图 2)〇
[0073] (3)反应参数设置
[0074] 1)探针检测模式设置为:荧光模式设置为FAM/NONE双标记模式。
[0075] 2)反应条件设置为:第一阶段，预变性94°C5min，l个循环；第二阶段，94°C15s，60 °C lmin，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
[0076] 3)质量控制：
[0077]阴性对照:在"FAM/N0NE"标记模式下的检测结果应为扩增曲线无对数增长期，且 Ct 值 >35.0 或无 Ct。
[0078] 阳性对照:在"FAM/NONE"标记模式下出现1条有明显对数增长期的扩增曲线，且Ct 值应<25.0。
[0079] 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
[0080] (4)结果判定
[0081 ]在检测结果成立的前提下：
[0082] 1)若在"FAM/N0NE"标记模式下待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩 增曲线，且Ct值< 32.0，则可判定为样品中存在FAdV-4。
[0083] 2)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值>35.0或无 Ct，则判定为FAdV-4阴性。
[0084] 3)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且32.0<Ct值 <35.0,则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0085] 1.2.7敏感性试验和标准曲线的建立
[0086]将步骤1.2.5中获得的pGEM-FAdV-4阳性重组质粒进行10倍系列稀释，质粒终浓度 调整为1.0 X 107~1.0X 10°拷贝ΛΛ，共8个稀释度，以灭菌双蒸水为阴性对照，按步骤1.2.6 优化的FQ-PCR反应条件进行FAdV-4FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-FAdV-4阳性重组质粒 起始模板浓度为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立FQ-PCR方法的标准曲 线。FQ-PCR检测pGEM-FAdV-4阳性重组质粒的最低检出限均为1 .OX 101拷贝ΛΛ。
[0087] 由敏感性检测结果建立的标准曲线，相关系数R2为0.998，斜率为-2.802，截距为 33.721，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式:y = -2.8021ogX+33.721
[0088] 根据仪器读取的Ct值代入表达式就可算出FAdV-4的初始拷贝数（图3~图4)。
[0089] 1.2.8特异性试验
[0090] 按步骤1.2.2所述方法对灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒阳性对照、正常SPF鸡 胚尿囊膜阴性对照、禽腺病毒I亚群中其他11个血清型病毒(FAdV-Ι~-3、FAdV-5~-12)、减 蛋综合征病毒（EDSV-76)、等提取DNA，按步骤1.2.3所述方法对H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病毒（IBDV)传染性贫血 因子(CIV)、禽白血病病毒(ALV)等提取RNA并按步骤1.2.4进行反转录，按步骤1.2.6优化的 FQ-PCR反应条件进行FAdV-4FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。结果表明灭活的FAdV-4鸡 胚绒毛尿囊膜病毒阳性对照FQ-PCR扩增Ct值为15.56,且出现特定的扩增曲线;但禽腺病毒 I亚群中其他11个血清型病毒(FAdV-Ι~-3、FAdV-5~-12)、减蛋综合征病毒(EDSV-76)、H9 亚型禽流感病毒(AIV H9)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病 毒（IBDV)、传染性贫血因子(CIV)、禽白血病病毒(ALV)、正常SPF鸡胚尿囊膜等均未出现特 定的扩增曲线。实验结果见图5。
[0091] 1.2.9稳定性和重复性试验
[0092] 分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-FAdV-4阳性重组质粒(终浓度1.0 X 106~ 1.0 X 104,1.0 X 10°)按照步骤1.2.6优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重 复，分成3个批次进行验证该方法的稳定性和重复性。重复性试验结果表明，浓度为1.0 X 1〇6拷贝/yL、1.0 X 105拷贝AiL、1.0 X 104拷贝AiL的3个浓度的pGEM-FAdV-4重组质粒等量混 合物3次试验结果均为阳性，浓度为1.0 X 10*3拷贝/VL的pGEM-FAdV-4重组质粒等量混合物3 次试验结果均为阴性，表明建立的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4 )FQ-PCR方法 具有很好的稳定性和重复性(图6)。
[0093] 实施例2,禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒（FAdV_4)TaqMan MGB荧光定量PCR (FQ-PCR)检测技术的应用。
[0094] 依据本发明实施例1建立的禽腺病毒I亚群C种第4血清型病毒(FAdV-4)FQ-PCR检 测方法和本研究建立的PCR方法，配制检测试剂，以灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒为阳 性对照、正常SPF鸡胚尿囊膜为阴性对照，对47份临床疑似FAdV-4感染样品（样品编号为：1 ~47)进行了应用检测，对这两种方法的检测结果进行比较分析，并与测序结果比较。结果 表明，采用本发明提供的FAdV-4FQ-PCR方法检测，17份为FAdV-4基因阳性，编号分别为8~ 10、16、18、20、32~38、41、42、45、47 ;采用普通卩〇?检测，15份卩厶狀-4基因阳性，编号分别为9 ~10、16、18、20、32~38、42、45、47(见图7、8)。表明本发明建立的?六狀-4?0-?〇?检测方法比 PCR方法的灵敏性高，该FQ-PCR方法检测结果与基因测序结果符合率为100%。
[0095]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述FAdV-4 TaqMan MGB荧光定量PCR检测 试剂包括1对特异性引物对和1条荧光探针； 所述特异性引物对的核苷酸序列SEQ ID NO. 1~2,荧光探针的核苷酸序列SEQ ID Ν0·3〇2. 如权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述FAdV-4 TaqMan MGB荧 光定量PCR检测试剂还包括:DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、阴性模板、阳性模板； 所述阴性模板为正常SPF鸡胚绒毛尿囊膜DNA，所述阳性模板为灭活FAdV-4鸡胚绒毛尿 囊膜病毒DNA。3. -种如权利要求1所述荧光定量PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方 法包括以下步骤： 步骤一，筛选出FAdV-4六邻体蛋白基因高度保守且具有FAdV-4型特异性基因序列，设 计检测FAdV-4六邻体蛋白基因的1对特异性引物对和1个TaqMan MGB探针，分别命名为 FAdV-F(Pl)、FAdV-R(P2)和FAdV-MGB-FAM-探针Probe-P3; 步骤二，模板DNA的制备：以灭活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒为阳性对照，以正常SPF 鸡胚尿囊膜为阴性对照，与含有FAdV-4的拭子、气管、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、心包积液待检 样品提取总DNA; 步骤三，采用Trizol法提取总RNA; 步骤四，反转录，每管反转录反应体系含如下成份：5X M-MLV缓冲液4yL; 2.5mmo I /L dNTPs4 yL;M-MLV反转录酶O · 5yL;RNA酶抑制剂O · 5yL;随机引物IyL;总体积IOyL; 步骤五，pGEM-FAdV-4标准品的制备，将含有FAdV-4六邻体蛋白基因的阳性扩增产物分 别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒采用T7和SP6引物进行测序； 步骤六，优化的25yL PCR反应体系中，FAdV-4上、下游引物P1/P2终浓度分别为0.4μ mol/L、0 · 5ymol/L，Probe-P3终浓度为0 · 6ymol/L，2 · 5mmol/L，dNTPs 2yL，10 XEx Taq酶缓 冲液2.5yL，5U/yL Ex Taq DNA聚合酶0.25以1^，1.0\104拷贝/^的质粒模板各2以1^，去离子 水补足至总体积25yL;PCR反应程序为:94°C，5min; 94°C 15s，60°C 30s，40个循环； 步骤七，将获得的pGEM-FAdV-4阳性重组质粒进行10倍系列稀释，质粒终浓度调整为 1.0 X IO7~1.0 X IOq拷贝AiL，共8个稀释度，以灭菌双蒸水为阴性对照，按优化的FQ-PCR反 应条件进行FAdV-4FQ-PCR敏感性试验，分别以pGEM-FAdV-4阳性重组质粒起始模板浓度为X 轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立FQ-PCR方法的标准曲线。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取总DNA具体操作如下：分别取灭 活的FAdV-4鸡胚绒毛尿囊膜病毒、阴性对照及待检样品各IOOyL于1.5ml离心管中，加入500 yL消化液:含终浓度IOmM Tris-HCUpH 8.0,终浓度25mM EDTA、pH 8.0,重量体积比终浓度 0.5 % SDS、终浓度IOOmM NaCl，然后和IOyL终浓度20mg/mL蛋白酶K混匀；置55 °C水浴30min ~Ih，加入500yL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇，体积比为25:24:1混合液抽提，离心后吸取上 清液加入等体积经一20°C预冷的异丙醇沉淀DNA，用质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥， 最后加入20yL TE缓冲液溶解沉淀，一20°C冻存备用。5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述采用Trizol法提取总RNA具体操作 如下：分别取待检样品各200yL于1.5ml离心管中，再加入600yL的Trizol于祸旋器震荡2~ 3min，加入200yL氯仿，离心后，取上清转入另1.5ml离心管中，加200yL异丙醇沉淀，质量百 分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20yL DEPC水溶解沉淀，取IOyL用于反转录，其余一20 °C保存。6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述测序正确的六邻体蛋白基因阳性重 组质粒应用分光光度计测定其OD26q和OD 28q值及OD26Q/OD28()值，共重复5次，参考质粒DNA拷贝 数计算方法，计算pGEM-FAdV-4质粒DNA溶液的浓度为8.02 X IOiq拷贝AiL，定量稀释至1.0 X IO0~1.0 XlO1t3拷贝ΛΛ，一20°C保存备用。7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述由敏感性检测结果建立的标准曲 线，相关系数R2为〇. 998，斜率为-2.802，截距为33.721，从而得出拷贝数X与Ct值之间的线 性关系表达式:y = -2 · 8021ogX+33 · 721。8. -种如权利要求1所述荧光定量PCR检测试剂的检测方法，其特征在于，所述检测方 法包括:采用1对特异性引物对和1条TaqMan MGB荧光探针对样品模板进行荧光定量PCR方 法检测；所述1对特异性引物对的核苷酸序列SEQ ID NO. 1~2,1条荧光探针的核苷酸序列 SEQ ID NO.3;在阴性、阳性结果成立的条件下，若样品中检测到FAdV-4基因阳性，则样品中 存在FAdV-4核酸;反之则为阴性。9. 如权利要求8所述检测方法，其特征在于，在阴性、阳性结果成立的条件下，根据Ct值 和荧光强度判断结果。
【文档编号】C12Q1/70GK105907893SQ201610448176
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】闫若潜, 吴志明, 班付国, 赵雪丽, 王华俊, 王东方, 马震原, 谢彩华, 曹伟伟, 王淑娟, 刘梅芬, 朱前磊, 仲伟平, 张和平, 安利民, 陈少渠, 周婷婷, 杜少甫
【申请人】河南省动物疫病预防控制中心