非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作为有效成分的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作为有效成分的组合物，尤其是涉及非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，将聚甘露糖醛酸作为底物由海藻酸裂解酶分解的分子量为100?3000Da以下，提供包含上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作为有效成分的肥胖、糖尿病及更年期综合征的改善、预防或治疗用药剂学组合物及肠道有益菌增进用益生菌。根据本发明，本发明的抗肥胖、抗糖尿病、雌激素活性及肠内微生物菌落调节效果与非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸寡糖相比显著优秀。
【专利说明】
非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作为有效 成分的组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作为有效成分的 组合物。
【背景技术】
[0002] 在现代社会中，随着因肥胖(2014年基准，经济合作与发展组织(0E⑶)成人的18% 为肥胖)及糖尿病（2011年基准，6.9 %为糖尿病）而发生的复合性代谢综合征(metabo 1 ic syndrome)增加，功能性食品市场正在扩大。
[0003] 代谢综合征是指因肥胖和胰岛素抵抗性而发生的第2型糖尿病和多种代谢异常复 合性地发生的综合征。代谢综合征随着因人口的高龄化和高热量的饮食习惯等而急增，需 要多的社会费用，从而当前，急需根本性的原因预防及医药品或食品原材料开发。在人类的 肠内生态系统中，出生的同时，微生物开始栖息，来使有益菌和有害菌维持均衡，形成肠内 微生物菌落，与人类共生，并通过相互作用，来对人类的健康产生直接或间接的影响。最近， 美国国立卫生研究院(NIH)通过"人体微生物群落项目"来研究肠内微生物菌落和疾病之间 的关系，从而随着微生物菌落的不均衡对炎症性肠道疾病等的发病提供重要的原因，突出 了肠内微生物菌落的正常化的重要性。
[0004] 根据2006年科学杂志"自然(Nature)"中发表的肥胖和肠内细菌的连贯性论文，确 认如下：瘦的人和肥胖的人之间的肠内细菌分布不同，通过利用小鼠的实验，在肥胖的小鼠 中，属于厚壁菌门（Firmicut es)的细菌与属于拟杆菌门（Bacteroidetes)的细菌相比，呈 现相对高的组成比率。之后，对肠内微生物和人体的研究在多种领域中进行，为了改善肠内 微生物区来抑制肥胖并疾病治疗等，需要开发肠内微生物菌落改善剂。
[0005] 推定海洋生物中栖息有地球上相当于生物种的约80%的约50万种的生物，但其 中，开发为有用生物资源的生物却小于1%，因而开发潜在力非常高。作为来源于海藻类的 功能性原材料，代表性的海藻多糖类海藻酸(alginic acid)在海带、裙带菜等褐藻类中包 含15-35%，并具有0-〇-甘露糖醛酸(0-〇-11^11111^〇111〇3(^(1 ;]\〇和€[-1^-古洛糖醛酸（€[-1-guluronic acid;G)的两种糖醛酸(uronic acid)以各种比率进行1，4配醣(glycoside)结 合的多糖醛酸苷(polyuronide)的特征。来源于海藻酸的寡糖根据组成糖可分为甘露糖醛 酸寡糖（M0S，mann uro-oligosaccharide)、古洛糖酸酸寡糖（G0S，gulur0-oligosaccharide)及甘露糖酸酸古洛糖酸酸混合寡糖(AOS，alginate oligosaccharide)， 并且，根据糖末端的双键可进行区分。
[0006] 来源于海洋的多糖类从前开始利用于人类生活中，世界上针对来源于海洋生物的 抗癌、抗氧化、抗高血压及抗菌物质等的生理活性等的研究正活跃地进行。全世界上生产的 海藻酸元祖生产量为约10万吨，其中，30%左右利用为食品添加物，但在将上述海藻酸作为 高附加医药品原料进行开发的情况下，可使其价值加倍。在来源于海藻酸的寡糖的情况下， 随着实现可视性的研究成果，应用领域广泛地扩散，上述研究成果中，根据结构性特征报告 高等植物的根部生长促进、双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)生长促进、抗炎症、抗氧化、抗 菌作用的生物学活性等。
[0007] 本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术 领域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
[0008] 本发明人为了增进向将海藻酸寡糖作为原材料的医药品及食品的利用而努力。最 终查明抗肥胖、抗糖尿病、肠内微生物菌落改善及雌激素功效等具有多种生理活性的来源 于海藻酸的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，从而完成了本发明。
[0009] 因此，本发明的目的在于，提供非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖。
[0010] 本发明的再一目的在于，提供肥胖改善、预防或治疗用组合物。
[0011] 本发明的另一目的在于，提供糖尿病改善、预防或治疗用组合物。
[0012] 本发明的还一目的在于，提供肠道有益菌增进用益生菌。
[0013] 本发明的又一目的在于，提供更年期综合征改善、预防或治疗用组合物。
[0014] 本发明的其他目的及优点通过以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更 明确。
[0015] 根据本发明的一实施方式，本发明提供非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡 糖，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖将聚甘露糖醛酸(poly-mannuronate)作 为底物由海藻酸裂解酶(alinate ly ase)分解的分子量为100_3000Da以下。
[0016] 本发明人为了增进向将海藻酸寡糖作为原材料的医药品及食品的利用而努力。最 终，查明抗肥胖、抗糖尿病、肠内微生物菌落改善及雌激素功效等具有多种生理活性的来源 于海藻酸的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖。
[0017]在本说明书中，术语"非还原性"是指在寡糖的结构中，不具有异头(在生成单糖类 的半缩醛(C-1与C-5之间的环形成）、半缩酮(C-2与C-5之间的环形成）的环化反应中附着于 一个碳的氢原子和羟基的位置被换的部分立体异构体的现象)碳的性质。
[0018] 在本说明书中，术语"不饱和型"是指氢原子的碳链(carbon ch ain)不饱和的形 态，"饱和型"是指氢原子的碳链饱和的形态。
[0019] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖是指不具有异头碳，而氢原子 的碳链不饱和的形态的所有甘露糖醛酸寡糖。
[0020] 上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖具有以下一例（结合有3个糖的甘 露糖醛酸寡糖)的结构式1。
[0021] 结构式1
[0022]
[0023] 上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖具有如下Z-平均分子量(m/z)(图 2):在单糖的情况下Z-平均分子量为175，在二糖的情况下Z-平均分子量为351，在三糖的情 况下Z-平均分子量为527,在四糖的情况下Z-平均分子量为704,在五糖的情况下Z-平均分 子量为880,在六糖的情况下Z-平均分子量为1056,在七糖的情况下Z-平均分子量为1232。
[0024] 并且，在本说明书中，术语"非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖"是指酸水解 聚甘露糖醛酸来取得的饱和型甘露糖醛酸寡糖。
[0025] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖通过将聚甘露糖醛酸作为底 物由海藻酸裂解酶分解而制备。
[0026] 根据本发明的一实例，上述海藻酸裂解酶是指对由聚古洛糖醛酸 (polyguluronate)及聚甘露糖醛酸(polymannuronate)组成的海藻酸(alginate)进行分解 来低分子化的酶。
[0027]根据本发明的特定实例，上述海藻酸裂解酶为来源于鲍鱼肠内菌株的AlyDWll(韩 国登录特许10-1277706)。
[0028] 本发明的上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖由一个以上的糖形成。
[0029] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖包含1个至 10个甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘 露糖醛酸寡糖包含1个至9个甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根据本发明的另一实例，上述非还 原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖包含1个至8个甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根据本发明 的特定实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖包含1个至7个甘露糖醛酸或古 洛糖醛酸。
[0030] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖与非还原性末端的饱和型甘 露糖醛酸寡糖相比，去除了水分子，从而具有作为水分子的质量值的18左右的小的质量值 (图 2)。
[0031] 本发明的上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖由甘露糖醛酸及古洛糖 醛酸形成。
[0032] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛 酸与古洛糖醛酸之比为1.2-5.0:1。根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型 甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比为1.2-4.5:1。根据本发明的另一实例，上 述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比为1.8-4.0: 1。根据本发明的特定实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸与 古洛糖醛酸之比为2.0-3.0:1。
[0033] 即，本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖中，与古洛糖醛酸相比，优 势1.2-5.0倍、1.2-4.5倍、1.8-4.0倍或2.0-3.0倍包含甘露糖醛酸(图4)。
[0034] 根据本发明的再一实施方式，包含含有上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸 寡糖作为有效成分的肥胖改善、预防或治疗用组合物。
[0035] 在本说明书中使用的术语"肥胖"是指对健康导致异常程度的脂肪组织在体内过 剩地积累的状态。
[0036] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖抑制脂肪积累。
[0037] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖对中性脂肪 的积累抑制20-60%、25-50%或30-40%，非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖抑制10-30%、10-25% 或 10-30%。
[0038] 根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖与非还原 性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖相比，将中性脂肪的积累抑制2倍以上。
[0039] 上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖调节诱导肥胖的肠内微生物菌落。
[0040] 在本说明书中，术语"肠内微生物菌落（intes t inal mi crof 1 ora或g ut mi croflora)"是指在构成的动物的消化道中生长的微生物复合体群落（complex community)。众所周知，构成肠内微生物菌落的各个微生物借助物质生产或分解能力对宿 主带来危害或利益，从肠内菌落整体上考虑，参与维生素供给、感染防止及肠功能(蠕动运 动及吸收），由此，菌落的组成与便秘、肠相关疾病发生等具有密切的关系（Mistu oka T.Bifidobacteria Microflora，1(1):3，1982)〇
[0041] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖通过减少肠 内微生物菌株的生长来调节肠内微生物菌落。
[0042]根据本发明的再一实例，上述肠内微生物菌株为选自由罗斯氏菌属(Roseburia sp.)及乳杆菌属(Lactobacillus sp.)组成的组中的菌株。
[0043] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖抑制诱导肥胖的与脂肪-分化 相关的基因的表达。
[0044] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖抑制脂肪细 胞蛋白2(aP2，adipocyte protein 2)、CAAT增强子结合蛋白a(C/EBPa，CAAT enhancer binding proteina)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ΡΡΑΙ?γ，Peroxisome Proliferator-Activated Rece ptory)的表达。
[0045] 根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖对脂肪细 胞蛋白2、CAAT增强子结合蛋白α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达分别抑制15-35%、50-70%及30-50%。这种效果与非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖相比，优秀 1.5 至 7.0 倍。
[0046] 本发明的肥胖改善、预防或治疗用组合物可制备成肥胖预防或治疗用药剂学组合 物、肥胖改善或预防用食品组合物或功能性食品组合物。
[0047]根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛 酸寡糖作为有效成分的糖尿病改善、预防或治疗用组合物。
[0048]在本说明书中，术语"糖尿病"是指特征为由导致葡萄糖-不耐受（intolerance)的 胰岛素的相对或绝对不足的慢性疾病。术语糖尿病包含所有种类的糖尿病，例如，包含第1 型糖尿病、第2型糖尿病及遗传型糖尿病。第1型糖尿病作为胰岛素依赖性糖尿病，主要由β-细胞的破坏导致。第2型糖尿病作为胰岛素非依赖性糖尿病，由饭后不充分的胰岛素的分泌 导致或胰岛素的耐性导致。
[0049] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖促进葡萄糖 (glucose)的吸收(uptake)。
[0050] 本发明的这种效果是在非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖中未呈现的只属 于非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的效果。
[0051] 根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖介导腺苷 酸活化蛋白激酶(AMPK，AMP_activated Proein Kina se)路径来促进糖的吸收。
[0052]本发明的糖尿病改善、预防或治疗用组合物可制备成肥胖预防或治疗用药剂学组 合物、糖尿病改善或预防用食品组合物或功能性食品组合物。
[0053]根据本发明的还一实施方式，本发明提供肠道有益菌增进用益生菌，上述肠道有 益菌增进用益生菌包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分。
[0054]本发明的肠道有益菌增进用益生菌增进肠道有益菌的生长。
[0055] 在本发明的一实例中，上述肠道有益菌为选自由罗斯氏菌属及乳杆菌属组成的组 中的肠道有益菌。
[0056] 在本说明书中，术语"益生菌"是指有助于宿主有机体健康的生菌的食品辅助剂。 本发明的益生菌组合物可制备成发酵乳产品，但也可制备成颗粒、粉末等的形态。
[0057]本发明的益生菌组合物的给药方法并不受特别限定，但还可制备成丸剂、片剂等 来以口服的方式给药，还可制备成粉末型或颗粒型，来添加于食物而给药。本发明的组合 物，例如，作为医药品使用的情况下的剂型对各成分的粉末不进行制剂化，而可直接使用， 但是可制剂化成散剂、颗粒剂、细粒剂、片剂、糖衣片剂、胶囊剂、肠溶包衣剂等的形态。作为 稀释剂，使用用于普通医药品制剂的赋形剂、结合剂、崩解剂等，除此之外，还可添加着色 剂、稳定化剂、保鲜剂、润滑剂等。在使用本发明的饮食用组合物作为食品的情况下，可按原 来不制剂化各成分的粉末而使用，但还可添加其他植物纤维、寡糖、谷物类、维生素类等，或 添加香料、着色剂、甜味剂等，来加工并形成为适合摄取的形态。并且，作为食品添加剂，还 可以在其他食品中添加并混合来使用。
[0058]本发明的肠道有益菌增进用益生菌可制备成药剂学组合物、食品组合物或功能性 食品组合物。
[0059] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛 酸寡糖作为有效成分的更年期综合征改善、预防或治疗用组合物。
[0060] 在本说明书中，术语"更年期综合征"为女性内分泌综合征的一种，指与自然损失、 由外科手术导致的损失或以化学的方式诱导的损失无关地发生卵巢功能的全方面且渐进 性的减少，导致生理功能及性功能减退或消失的过渡期，作为更年期的一个过程，出现卵巢 功能停止之后发生的属于生理的永久性停止的闭经。在闭经期，根据雌激素生成的减少、卵 泡刺激素及黄体激素的上升等激素的变化，可呈现急慢性症状。即，作为初期症状，可呈现 潮热、盗汗等的血管运动型症状和心慌、集中力减退、忧郁症等的心理症状，在闭经几年内 呈现的泌尿生殖系统及表皮症状在闭经几年之后有可能存在骨质疏松症、心血管及脑血管 等的疾病。
[0061] 上述更年期综合征包括选自由面部潮红、出汗、心脏不适、睡眠问题、抑郁症、过敏 性、心慌、身体疲劳、精神疲劳、性问题、排尿问题、阴道干涩、关节不适及肌肉不适组成的组 中的综合征。
[0062] 本发明的包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分的组合物 使雌激素的活性增加。
[0063] 上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖经由将雌激素作为配体起作用的 雌激素受体路径及雌激素非依赖性地起到作用的雌激素相关受体α路径通过雌激素反应元 件（estrogen response element;ER Ε)-介导下部基因的表达活性化雌激素。
[0064] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖经由雌激素 受体α来诱导雌激素反应元件的表达。
[0065] 根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖使雌激素 相关受体α表达来诱导雌激素反应元件的表达。
[0066] 由于上述雌激素反应元件的表达，通过下部雌激素基因的表达增加雌激素的活 性。
[0067] 根据本发明的另一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖使早老素 2(pS2，Presenilin 2)、孕激素受体（PR，Progestero n Receptor)及组织蛋白酶D(CTSD， E2_mediated Cathepsin D)信使核糖核酸(mRNA)的表达增加。
[0068] 根据本发明的再一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖使过氧化 物酶体增殖物激活受体γ共激活因子(PGC-Ια，Perox isome proliferator-activated receptor gamma coactivator l-α)、雌激素相关受体a(ERRa，Estrogen_related receptora)、GATA结合蛋白 3(GATA3，Trans-acting T-cel 1-specific Transcription Factor)及叉头框蛋白A1(F0XA1，Forkhead box protein Al)信使RNA的表达增加。
[0069] 上述GATA结合蛋白3及叉头框蛋白Al为对乳房细胞分化重要的因子，并起到抑制 向癌细胞或恶性肿瘤的分化的作用。
[0070] 本发明的组合物还包含17β-雌二醇（170_estradiol)。
[0071] 根据本发明的一实例，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖呈现与17β_ 雌二醇的协同效应(synergic effect)。
[0072] 本发明的组合物可制备成更年期综合征预防或治疗用药剂学组合物、更年期综合 征改善或预防用食品组合物或功能性食品组合物。
[0073] 本发明的(a)肥胖改善、预防或治疗用组合物、（b)糖尿病改善、预防或治疗用组合 物、（c)肠道有益菌增进用益生菌及(d)更年期综合征改善、预防或治疗用组合物可制备成 药剂学组合物。
[0074]根据本发明的优选实例，本发明的组合物为(a)上述本发明的非还原性末端的不 饱和型甘露糖醛酸寡糖的药剂学有效剂量及(b)包含在药剂学上接受的载体的药剂学组合 物。在本说明书中，术语"药剂学有效剂量"是指用于实现上述的非还原性末端的不饱和型 甘露糖醛酸寡糖的功效或活性的充分的量。
[0075] 在本发明的组合物制备成药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含在 药剂学上接受的载体。包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通 常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸 盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸 甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合 物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂 等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于Remington ' s Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。
[0076] 本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服的方式给药，优选地，以口服给药的 方式适用。
[0077] 本发明的药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素可多样地处 方。本发明的药剂学组合物的通常的给药量以成人为基准在0.001yg/kg-100mg/kg范围内。
[0078]本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的 方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制 备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆 剂或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，还可包含 分散剂或稳定剂。
[0079]在本说明书中，"包含…作为有效成分"是指包含用于实现上述的非还原性末端的 不饱和型甘露糖醛酸寡糖的功效或活性的充分的量。有关上述的非还原性末端的不饱和型 甘露糖醛酸寡糖包含于本发明的组合物的量的上限，本发明所属技术领域的普通技术人员 可在适当的范围内选择而实施。
[0080] 本发明的(a)肥胖改善、预防或治疗用组合物、（b)糖尿病改善、预防或治疗用组合 物、（c)肠道有益菌增进用益生菌及(d)更年期综合征改善、预防或治疗用组合物可制备成 食品组合物。
[0081] 在本发明的包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分的组合 物制备成食品组合物的情况下，作为有效成分，不仅包含非还原性末端的不饱和型甘露糖 醛酸寡糖，还包含制备食品时通常所添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营 养素、调味剂及香味剂。作为上述碳水化合物，例如有作为单糖的葡萄糖、果糖等、作为二糖 的麦芽糖、蔗糖、寡糖等以及作为多糖的糊精、环糊精等的通常的糖及木糖醇、山梨糖醇及 赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂，可使用天然香味剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如， 莱鲍迪苷A、甘草甜素等））及合成香味剂(邻苯甲酰磺酰亚胺、阿斯巴甜等）。例如，在本发明 的食品组合物制备成清凉剂的情况下，除了本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸 寡糖之外，还可包含柠檬酸、液态果糖、食糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、枣提 取液、甘草提取液等。
[0082] 本发明的包含非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分的组合物 可制备成功能性食品组合物。在本发明的组合物制备成功能性食品组合物的情况下，包含 制备食品时通常所添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素及调味剂。例 如，在制备成清凉剂的情况下，作为有效成分，除了非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡 糖之外，还可包含香味剂或天然碳水化合物。例如，天然碳水化合物包含单糖（例如，葡萄 糖、果糖等）、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等）、寡糖、多糖(例如，糊精、环糊精等)及糖醇(例如， 木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等）。作为香味剂可使用天然香味剂(例如，奇异果甜蛋白、甜 叶菊提取物等)及合成香味剂(例如，邻苯甲酰磺酰亚胺、阿斯巴甜等）。
[0083] 本发明的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为以往公知的海藻酸的生 理活性的活性成分呈现抗肥胖、抗糖尿病、更年期综合征改善及肠内微生物菌落的调节效 果。这种效果与非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖相比，呈现显著优秀的效果，由此， 意味着在呈现上述效果时，在非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖中出现的末端糖的 双键及其的不饱和形态为重要的因素。
[0084]归纳本发明的特征及优点如下：
[0085] (a)本发明提供非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖、包含其作为有效成分 的肥胖、糖尿病及更年期综合征的改善、预防或治疗用药剂学组合物及肠道有益菌增进用 益生菌。
[0086] (b)本发明制备作为海藻酸活性物质的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡 糖，来提供其的优秀的抗肥胖、抗糖尿病、雌激素活性及肠内微生物菌落调节效果。
[0087] (c)这种效果与以往的呈现非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖的形态的甘露 糖醛酸寡糖相比显著优秀。
【附图说明】
[0088] 图1表示非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的薄层色谱法结果。
[0089] 图2表示非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖及非还原性末端的饱和型甘露 糖醛酸寡糖的质量分析结果。
[0090] 图3表示非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖（Non-reducin g end of unsaturated Mannuroic Acid Oligosaccharide;USM0S)及非还原性末端的饱和型甘露糖 酸酸寡糖（Non-reducing end of saturated Mannuroic Acid Oligosaccharide;SM0S)的 双键比率。
[0091 ] 图4表示利用圆二色谱(CD，circular dichorism)法确认非还原性末端的不饱和 型甘露糖醛酸寡糖及非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖(SM0S)的糖结构的结果。 [0092]图5a及图5b表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖处理的脂肪积累 抑制结果及利用实时聚合酶链式反应(PCR)的肥胖相关基因、脂肪细胞蛋白2、CAAT增强子 结合蛋白α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达抑制效果。
[0093]图6a至图6c表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖处理的糖吸收促 进结果及相关蛋白质、磷酸化P21活化激酶(p-PAK)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及磷酸化 AS160(p-AS160)的表达量。
[0094]图7a及图7b表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖腹腔给药的肥胖 诱导小鼠的肠内菌落分析结果。
[0095] 图8表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的饮用摄取的老龄小鼠的 肠内微生物菌落主坐标(PC0,principal coordinate)分析结果。
[0096] 图9表示在门（phylum)中比较分析根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖 的饮用摄取的老龄小鼠的肠内菌落变化的结果。
[0097]图10a及图10b表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖处理的早老素 2、孕激素受体及组织蛋白酶D的信使核糖核酸表达量。
[0098] 图11表示根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的处理的过氧化物酶体 增殖物激活受体γ共激活因子、雌激素相关受体a、GAT A结合蛋白3及叉头框蛋白A1的信使 核糖核酸表达量。
[0099] 图12表示非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的作用机制。
[0100]图13表示非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的多种生理活性效果。
【具体实施方式】
[0101]以下，详细说明本发明的实施例，以便本发明所属技术领域的普通技术人员可容 易实施。但是，本发明能够以多种不同的方式实现，并不局限于在此说明的实施例。
[0102]实施例1:海藻酸寡糖的制备
[0103] 为了制备聚甘露糖醛酸(poly-mannuronate;poly M)，与lg的海藻酸钠（日本大阪 和光(Wako，0saka Japan)公司）一同，添加100ml的0.3M的HC1，并在100°C温度下加热2小 时。将经加热的500g的海藻酸钠-HC1溶液离心分离5分钟，来将分离的沉淀物溶解于蒸馏 水。添加 NaCl使得溶解于蒸馏水的沉淀物成为0.1M之后，将pH调节为2.8-3.0来制备500g， 并离心分离5分钟来分离了上清液和沉淀物。已分离的沉淀物和上清液利用乙醇沉淀之后 进行干燥，从而将上清液部分制备成poly Μ，将沉淀物部分制备成poly G来用作用于制备 利用海藻酸分解酶的甘露糖醛酸寡糖的底物（Haug，A et al.A stu dy of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis.Act aChemicaScandinavica，1966,20(l):183-190.及Joo，D.S.et al.Pre paration of oligosaccharides from alginic acid by enzymic hydrolysis.Korean Society of Food Science and Technology,1996,28(1):146-151)〇
[0104]为了制备非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，利用如下基因转化菌株： 2009年2月在韩国丽水近海中栖息的鲍鱼的肠内脱氧核糖核酸(DNA)宏基因组文库中筛选 的、相当于甘露糖醛酸分解能力优秀的0RF11的基因重组于pMAL-c2x表达载体之后，对BL21 (DE3)菌株实施克隆而制备(韩国登录特许10-1277706)。
[0105] 在添加有40L的氨节青霉素 （ampici 1 lin，100μg/ml)的培养基（LB，Luria-Bertani)中接种500ml的上述基因转化菌株，来在37°C温度下进行培养，在600nm条件下，当 吸光度成为〇.4-〇.5时，添加异丙基-0-(1-硫代半乳糖苷（1?16，18叩^?71-0-〇-thiogalactopyranoside)，使得培养液的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的最终浓度成为0.3mM 后，培养了 12小时。培养结束之后，在9000g下将培养液离心分离15分钟来沉淀细胞。利用 pH7.0的10mM磷酸缓冲液(phosphate buffer)使沉淀的细胞漂浮之后，为了分解细胞膜，实 施超声波分解(sonication)，并为了分离辅酶，在9000g下，将离心分离实施15分钟。将进行 离心分离之后得到分离的上清液作为辅酶使用，作为底物，在1L的pH7.0的10mM磷酸缓冲液 中，将聚甘露糖醛酸(P〇ly-mannuronate(poly M))以0 · 3%的浓度溶解之后，添加 AgN〇3使 得最终浓度成为ImM。利用2.5L的发酵器(KBT KB-250，日本(Japan))在45°C温度下，将底物 分解反应进行了48小时。进行反应之后，为了获得分子量为3000D a以下的寡糖混合物，利 用超滤膜系统(^；^3?1〇￥50,531'1：01'；[118,48，德国（661'11^1150)进行过滤来冷冻干燥之后，制 备了非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖。
[0106] 为了确认是否生产寡糖，实施了薄层色谱法（thin-layer chromato graphy)，该 方法如下：在水中以0. lmg/μL浓度熔解非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖之后，在 硅胶板(德国默克集团(Merck KGa A，Germany))中实施了3μ1的合模。利用展开溶剂（1-丁 醇：甲酸:水= 4:6:1)按非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖大小进行分离之后，使用 添加了硫酸的发色试剂(〇. 5ml的茴香醛、10ml的乙酸、85ml的MeOH及5ml的出5〇4)来确认是 否存在寡糖。
[0107] 实施例2:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖结构及结构特征分析
[0108] 在本实验例中，利用AlyDWll海藻酸分解酶来分解聚甘露糖醛酸之后，针对已确保 的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖混合物利用超滤膜系统（（VivaFlow 50,赛多 利斯(Sartorius)))确保了分子量为3000Da以下的分馏物。为了分析非还原性末端的不饱 和型甘露糖醛酸寡糖的组成糖，针对已准备的试样，利用离子交换树脂柱(H itrap DEAE Sepharose FF，GE Healthcare)进行纯化之后，进行冷冻干燥。在水中恪解经纯化的非还原 性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖之后，注入于超高效液相色谱/质谱(UPLC/MS)系统，从 而进行组成糖分析。
[0109] 超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography;UPLC，沃特世 (Waters)公司）的设定利用了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7yml.0X100mm，沃特世公司）柱， 在0.4ml/分钟条件下，将溶剂A[ 15mM戊胺（Amylamine)及25mM的六氟异丙醇（HFIP，He 义已:1^11101'0丨8(^1'(^31101)]和溶剂13(15111]\1戊胺及乙腈（4〇61:〇11；[1：1'；[16)中的25111]\1的六氟异丙 醇）的线性梯度调节了 12分钟。利用质谱仪(Q uadrupole-Time of Flight，Q-T0F，沃特世 公司）分析了通过C18-超高效液相色谱法分离出来的洗脱液。在电喷雾离子源负模式中分 析了 Q-T0F，毛细管及采样锥（sampling cone)的电压分别为3kV及40V，脱溶剂 (desol vat ion)在流速为600L/h、温度为300 °C，源温度为120 °C的条件下实施。飞行时间质 谱仪(T0F MS)数据的扫描时间在0.5秒钟m/z 100-1300范围下进行分析。为了分析的准确 度，在所有分析中使用2ng/yl的亮氨酸脑啡肽（leucine enkephalin，在电喷雾离子源负模 式下554.2619Da)作为锁喷（lock spray)。
[0110] 从图2可知，根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的质量分析结果，非还 原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖由1个至7个糖构成，尤其，观察到与已报告的甘露糖 醛酸寡糖分子量相比少18的峰值，由此可知去除水分子来形成非还原性末端的不饱和型甘 露糖醛酸寡糖，从而优势于非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖(non-redu cing end of Saturated Mannuronic Acid Oligosaccharide;SM0S)而存在。
[0111] 在图2示出了非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖和非还原性末端的饱和型 甘露糖醛酸寡糖的比率。如图3所示，确认如下:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖 与非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖相比，存在平均2倍以上的非还原性末端的不饱 和型甘露糖醛酸寡糖的多个单糖。非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖的分子量如下： 单糖(m/z 193)、糖(m/z 369)、三糖(m/z 545)、四糖(m/z 722)、五糖(m/z 898)、六糖(m/z 1074)、七糖(m/z 1250)。
[0112] 为了测定上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸比率，利用 圆二色谱（Circular Dichroism;CD，J_715分光偏振计（spectropolarimeter)，日本分光公 司（JASC0))测定了圆二色谱信号。上述圆二色谱信号在常温条件下利用lcm的小槽，在190-250nm区域中进行测定，为了取得有一贯性的圆二色谱信号，以lmg/ml的浓度使用了上述非 还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖。为了了解甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的组成比，测 定顶点（峰值(peak)，200nm吸光度值）、低点（谷值(trough)，215nm吸光度值)来计算了甘露 糖醛酸与古洛糖醛酸的比率，计算式如下。
[0113] (1)峰值/谷值<1，甘露糖醛酸/古洛糖醛酸= 2.0(峰值/谷值）
[0114] (2)峰值/谷值>1，甘露糖醛酸/古洛糖醛酸=27(峰值/谷值)+40
[0115] 从图3可知，确认到非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸与古 洛糖醛酸之比为2.12 (峰值=6.66，谷值=6.42)。
[0116] 实施例3:根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的脂肪细胞的脂肪积累 抑制
[0117] 若在DMEM培养基中培养3T3-L1脂肪前体细胞来融合(conflue ncy)，则利用0.5mM 的异丁基甲基黄噪呤（isobutylmethylxanthine，I BMX)、ImM的地塞米松（dexamethasone) 及lμg/ml的胰岛素（以上MDI)处理两天之后，利用包含有lμg/ml的胰岛素的DMEM+血清培养 基以48小时的间隔进行更换，来7天向脂肪细胞诱导了分化。当更换培养基时，非还原性末 端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖以〇.2mg/ml的浓度进行处理，7天之后，通过进行油红〇染色 (Oil red 0 stain)及核糖核酸提取，观察脂肪细胞的脂肪积累及分化抑制程度，并在图4 中表示了结果。
[0118] 如图5a及图5b中公开，利用油红〇染色色素对中性脂肪进行染色之后，利用光学显 微镜观察细胞，最终发现，当以〇.2mg/ml浓度进行处理时，与对照组相比，非还原性末端的 不饱和型甘露糖醛酸寡糖的脂肪细胞的油红〇染色强度显著弱化。进而，在利用油红〇染色 的中性脂肪中提取色素来进行定量，最终发现与对照组相比，在非还原性末端形成双键的 不饱和型甘露糖醛酸寡糖将中性脂肪的积累抑制约40%，在非还原性末端的饱和型甘露糖 醛酸寡糖的情况下，与对照组相比，在脂肪积累抑制效果中仅抑制约15%左右，由此确认到 双键形成在抗肥胖效果中是重要的因素。
[0119] 利用相同方法将3T3-L1脂肪前体细胞分化成脂肪细胞之后，以0.2mg/ml的浓度处 理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖之后，根据GeneJET核糖核酸纯化试剂盒方法 提取核糖核酸之后，在图4中表示了作为脂肪分化指标的脂肪细胞蛋白2、脂肪分化相关基 因 CAAT增强子结合蛋白α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达抑制结果。
[0120]如图5a及图5b中公开，当处理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖时，确认 如下：与对照组相比，在表达量中，脂肪细胞蛋白2、CAAT增强子结合蛋白α及过氧化物酶体 增殖物激活受体γ分别被抑制25%、60%及40%。并且，确认到与非还原性末端的饱和型甘 露糖醛酸寡糖相比，抗肥胖效果优秀。
[0121] 实施例4:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖糖吸收调节确认
[0122] 在包含10%血清的DMEM培养基中培养L6肌肉细胞之后，利用2%血清培养基进行 更换，并使L6细胞完全分化。将已完全分化的L6肌肉细胞的培养基更换为无血清DMEM培养 基来以0.2mg/ml水平将非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖处理1小时之后，去除处 理有非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的培养基，利用预加热的37°CKRH缓冲液 (Krebs-Ringer Hepes 131^€61')清洗2次，来去除存在于培养基内的葡萄糖。以0.0411^[的浓 度将[3H]-2-脱氧葡萄糖（[3H]-2-d eoxyglucose)处理15分钟之后，迅速去除包含[3H]-2-脱氧葡萄糖的K RH缓冲液，并添加冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，从而停止反应。利用细胞溶 解缓冲液(Cell lysis buffer)破碎细胞之后，利用闪烁计数器(scintillation counter) 测定放射性(radioactivity)，来确认了根据海藻酸寡糖处理的葡萄糖运输能力增加效果。
[0123] 如图5a及图5b中公开，确认如下：当处理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡 糖时，与作为阳性对照组的胰岛素(0.2μΜ)相比促进了类似的细胞内糖吸收。当以0.2mg/ml 的浓度处理非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖时，未发生糖吸收，由此确认在糖吸收 促进中，非还原性末端的双键的形成是重要的，并确认如下：当一同处理在糖吸收中作为属 于重要蛋白质的腺苷酸活化蛋白激酶的抑制剂的c. C(C ompound C，1 μΜ)和非还原性末端 的不饱和型甘露糖醛酸寡糖时，随着糖吸收被抑制，非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸 寡糖通过腺苷酸活化蛋白激酶路径促进了糖吸收。
[0124] 如图6中公开，当处理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖时，为了了解对与 糖吸收促进相关的运载体的表达产生影响的PAK、A kt及AS160的磷酸化增加，按浓度在肌 肉细胞中进行处理，来提取蛋白质之后，通过蛋白质印迹法进行确认，最终确认到非还原性 末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖以浓度依赖的方式增加。因此，预计如下：为了促进糖吸 收，非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖促进腺苷酸活化蛋白激酶路径、PAK、Akt及 AS160的磷酸化，来对糖运载体(GLUT4,glucose transporter 4)的表达也产生影响。
[0125] 实施例5:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的肠内菌落调节功效的确认
[0126] 为了确认非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的肠内菌落改善功效，利用了 作为肥胖动物模型的大鼠和作为高龄动物模型的小鼠。诱导肥胖的大鼠在(株）中心动物中 购买生后3周龄的雄性SD大鼠来适应3天之后，将饲养环境调节为20±2°C，将相对湿度调节 为50±10%，并将明暗周期调节为1天12小时，来将高脂饮食诱导10周，从而在实验组中，针 对非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖以0.25mg/kg浓度且48小时周期实施腹腔给 药，并进行实验。作为高龄小鼠，在韩国基础科学研究院购买生后1个月龄及17个月龄雄性 C57BL/6J，将饲养环境调节为20 ± 2°C，将相对湿度调节为50 ± 10%，并将明暗周期调节为1 天12小时，来将实验实施10周，在实验组中，在供给的水中以0.2mg/kg的浓度供给了非还原 性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖。实验结束之后，收集实验动物的内脏内容物，然后采集 200mg的内容物，从而利用土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA?SPIN Kit for S oil kit)，来将 脱氧核糖核酸基于在试剂盒中公开的方法确保纯的脱氧核糖核酸，并为了确认已提取的脱 氧核糖核酸的浓度和纯度，利用分光光度计(nanodrop)进行测定之后，基于通过琼脂糖凝 胶电泳提取的脱氧核糖核酸带结果确认了脱氧核糖核酸浓度和纯度。为了确认经分离的脱 氧核糖核酸内细菌的16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因的扩增，利用与细菌特异性相结合的、 包含V1-V3高变区（hypervariable regio η)的27F正向引物（GAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 518R反向引物(WTTACCGCGGCTGCTGG)，来在94°C温度下，初期变性(den aturation)5分钟， 在94 °C温度下，初期变性30秒钟，在55 °C温度下，初期变性45秒钟，在72 °C温度下，以1分30 秒钟反复30次来进行扩增，从而执行聚合酶链式反应之后，针对通过QIAquick凝胶提取试 剂盒(德国凯杰公司（Qiagen，Germany))纯化的聚合酶链式反应产物，利用GS Junior钛系 统(Titanium system)(德国罗氏公司(Roche，Germany))碱基序列分析仪进行了焦磷酸测 序(pyrosequencing)，在焦磷酸测序所需的方法和多个反应根据制备公司（罗氏公司）的手 册在(株)韩国Chunlab研究所中进行。
[0127] 如图7中公开，将非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖给药的肥胖大鼠肠内 菌落的情况下，与对照组(肥胖诱导大鼠，高脂饮食(HFD，high fat diet))相比，属于革兰 氏阳性细菌(Firmicutes)的、作为抗肥胖指标菌株的罗斯氏菌属及乳杆菌属分别增加约 4%及2%，来发生菌落变化，并且，确认到属于革兰氏阴性细菌(Bacteroidetes)的梭状芽 孢杆菌属(Clostridium sp.)及瘤胃球菌属(Ruminococcus s ρ·)菌株分别减小约1 %。
[0128] 如图8中公开，通过PC0分析确认如下：在饮用摄取非还原性末端的不饱和型甘露 糖醛酸寡糖的高龄小鼠的情况下，与一个月龄的小鼠的肠内菌落类似，与17个月龄的小鼠 的肠内菌落有差异。并且，确认到形成了与非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖摄取 一个月龄类似的肠内菌落。
[0129] 如图9中公开，确认如下:在饮用摄取非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的 17个月龄的高龄小鼠的情况下，与对照组（17个月龄小鼠）相比，革兰氏阴性细菌 (1^1(^61'0丨(16七68)增加约22%，相对地，革兰氏阳性细菌(？；[1'111；[01^68)减少22%，从而与1个 月龄小鼠的肠内菌落类似地发生变化。
[0130] 实施例6:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的雌激素增减剂功能的确认
[0131] 在本研究中使用的17β_雌二醇从西格玛（Sigma)公司（美国密苏里州圣路易斯市 (St.Louis，M0，USA))购买使用，DMEM/F12(D ulbecco's modified Eagle's medium/F12)、 牛胎儿血清(Fetal bovine serum)、0pti-MEM培养基及青霉素-链霉素从美国纽约吉毕科 (Gib co，NY，USA)公司购买。磷酸盐缓冲液从We 1GENE(韩国大邱(D aegu，Korea))公司购买 使用，细胞计数试剂盒（CCK-8)从日本东京同仁化学分子技术（Do jindo Molecular Technologies，Tokyo，Japa η)公司购买使用，RNeasy小型试剂盒从凯杰公司（QIAGEN) (Hide n，德国）购买使用，牛胰岛素从美国圣地亚哥细胞应用（Cell Applic ations，San Diego，USA)公司购买使用，FuGENEHD从美国威斯康星州麦迪逊市普洛麦格（Promega， Madison，WI，USA)公司购买使用。
[0132] 在37°C温度下，在包含10%的牛胎儿血清、青霉素-链霉素（100U/ml)及1%牛胰岛 素的DMEM/F12培养基中，培养MCF-7细胞，来为了测定雌激素增减剂活性，确认了雌激素反 应元件-荧光素酶活性及早老素2、孕激素受体、组织蛋白酶D、过氧化物酶体增殖物激活受 体γ共激活因子、雌激素相关受体、GATA结合蛋白3及叉头框蛋白A1表达量。
[0133] 针对非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖以0.1mg/ml浓度处理48小时之后， 为了确认雌激素反应元件-荧光素酶活性，针对pEGF P-Cl-ERa、3X ERE TATA luc及pRL-SV40利用FuGENE HD试剂在MCF-7细胞中进行转染(transfect ion)之后熔解，来实施荧光素 酶分析，并根据GeneJET核糖核酸纯化试剂盒方法提取核糖核酸之后，利用实时聚合酶链式 反应确认了早老素2、孕激素受体、组织蛋白酶D、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因 子、雌激素相关受体、GATA结合蛋白3及叉头框蛋白Α1的表达量。
[0134] 如图10中公开，确认如下：当处理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖时，与 非还原性末端的饱和型甘露糖醛酸寡糖不同，作为雌激素信号下部基因的早老素2的表达 与对照组相比增加约5倍，并且，当雌激素(Ε2，17β-雌二醇）和非还原性末端的不饱和型甘 露糖醛酸寡糖并行处理时，借助雌激素受体a(ERa，estrogen receptora)的雌激素反应元 件荧光素酶活性及早老素2、孕激素受体的表达增加，并减少组织蛋白酶D的表达，来使非还 原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖选择性地调节雌激素受体a下部信号的基因的表达。
[0135] 如图11中公开，确认如下：当处理非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖时，使 过氧化物酶体增殖物激活受体y共激活因子（PGC-la，peroxisome prol if era tor-activated receptor c coactivator-la) 及作为转录伴侣的雌激素相关受体 a 的表达增 加，并与雌激素受体a路径一同作用来使GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3)和叉头 框蛋白A1的信使核糖核酸的表达增加，从而具有雌激素增减剂功效。
[0136] 实施例7:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的抗肥胖、抗糖尿病及雌激素 敏感性增大机制示意图
[0137] 在图12中公开了非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖的抗肥胖、抗糖尿病及 雌激素敏感性增进机制的整体示意图。
[0138] 如图12中公开，综合根据非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖处理的抗肥 胖、抗糖尿病及雌激素敏感性增大机制，最终，可确认如下：当处理非还原性末端的不饱和 型甘露糖醛酸寡糖时，通过腺苷酸活化蛋白激酶活性化增加过氧化物酶体增殖物激活受体 γ共激活因子的表达，并使作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子的转录伴侣的 ERRs(雌激素相关受体α、雌激素相关受体β、雌激素相关受体γ )活性化来促进脂肪酸β氧 化，从而具有抗肥胖效果。并且，据报道，肌肉内腺苷酸活化蛋白激酶随着介导脂肪酸的合 成和分解，通过促进脂肪酸β氧化代谢的作用及PGC-1表达使线粒体相关多个基因表达增 加，期待如下:非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖通过腺苷酸活化蛋白激酶活性化， 还增加 PCG-la表达，从而通过线粒体基因的表达及数量的增加具有改善胰岛素抵抗性的功 效。
[0139] 确认如下：非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为雌激素增减剂，当与雌 激素一同处理时，随着通过雌激素受体α路径来增加 G ΑΤΑ结合蛋白3及叉头框蛋白A1的信 使核糖核酸表达，并增加雌激素相关受体α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 的表达，非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖通过依赖于过氧化物酶体增殖物激活受 体γ共激活因子的雌激素受体α路径活性化雌激素反应元件，来具有雌激素增减剂的功能。
[0140] 并且，确认如下：非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖在体内通过改善肠内 菌落来增加抗肥胖指标菌株(罗斯氏菌属及乳杆菌属），并减少作为肥胖指标菌株(梭状芽 孢杆菌属、瘤胃球菌属），从而具有复合性的抗肥胖、抗糖尿病、肠内菌落改善及雌激素敏感 性增大功效。
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[0147] 以上，对本发明的特定部分进行了详细说明，就本发明所属技术领域的普通技术 人员来说，这种详细说明只属于优选实例，本发明的范围并不局限于此，这是显而易见的。 因此，本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案来定 义。
【主权项】
1. 一种非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，将聚甘露糖醛酸作为 底物由海藻酸裂解酶分解的分子量为100~3000Da以下。2. 根据权利要求1所述的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，上述 非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖包含1个至10个甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。3. 根据权利要求1所述的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，在上 述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖中，甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比为1.2~ 5.0:1〇4. 一种肥胖改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至3中任一项 所述的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分。5. 根据权利要求4所述的肥胖改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，上述非还原性 末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖减少肠内微生物菌株的生长。6. 根据权利要求5所述的肥胖改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，上述肠内微生 物菌株为选自由罗斯氏菌属及乳杆菌属组成的组中的菌株。7. 根据权利要求4所述的肥胖改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，上述肥胖改善、 预防或治疗用组合物为肥胖预防或治疗用药剂学组合物、肥胖改善或预防用食品组合物或 功能性食品组合物。8. -种糖尿病改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至3中任一 项所述的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分。9. 根据权利要求8所述的糖尿病改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，上述非还原 性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖促进葡萄糖的吸收。10. 根据权利要求8所述的糖尿病改善、预防或治疗用组合物，其特征在于，上述糖尿病 改善、预防或治疗用组合物为糖尿病预防或治疗用药剂学组合物、糖尿病改善或预防用食 品组合物或功能性食品组合物。11. 一种肠道有益菌增进用益生菌，其特征在于，包含上述权利要求1至3中任一项所述 的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分。12. 根据权利要求11所述的肠道有益菌增进用益生菌，其特征在于，上述肠道有益菌为 选自由罗斯氏菌属及乳杆菌属组成的组中的肠道有益菌。13. 根据权利要求11所述的肠道有益菌增进用益生菌，其特征在于，上述肠道有益菌增 进用益生菌为药剂学组合物、食品组合物或功能性食品组合物。14. 一种更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含上述权利 要求1至3中任一项所述的非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖作为有效成分。15. 根据权利要求14所述的更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物，其特征在 于，上述更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物还包含17β-雌二醇。16. 根据权利要求14所述的更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物，其特征在 于，上述非还原性末端的不饱和型甘露糖醛酸寡糖呈现与17β-雌二醇的协同效应。17. 根据权利要求14所述的更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物，其特征在 于，上述更年期综合征改善、预防或治疗用药剂学组合物为更年期综合征预防或治疗用药 剂学组合物、更年期综合征改善或预防用食品组合物或功能性食品组合物。
【文档编号】A61K31/702GK106008613SQ201610177823
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】金斗云
【申请人】全南大学校产学协力团