工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3R,5S)?6?氯?3,5?二羟基己酸叔丁酯的方法，与现有技术相比，反应过程中采用了本发明的工程化酮还原酶多肽，其不仅酶用量低，而且反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。
【专利说明】
工程化酬还原酶多化及其用于制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二哲 基己酸放T醋的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药和生物转化领域，具体设及一种工程化酬还原酶多肤及其用 于制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋的方法。
【背景技术】
[0002] (3R，5S)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋是一种手性药物搁块，可W用于合成包括 罗苏伐他汀(Rosuvas化tin)等药物，其结构如式1所示。
[0003]
[0004] (3R，5S)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋的常见合成方法如式2所示，其关键步骤在 于合成3-位的手性径基中屯、，将含有幾基的前体6-氯-(5S)-径基-3-幾基己酸叔下醋直接 还原成手性醇无疑是较为理想的方法。
[0005]
[0006] 该反应的实现方法主要有化学法和生物法。化学法例如Angew.化em. Int. Ed. 2000 ，39:4306-4307等报道，低溫下使用易燃易爆试剂，工艺复杂且环境友好性不高，产物de值 较低（93%)。生物法中的整细胞催化法如《化学反应工程与工艺》，2006,26:554-559和 Korean J.化em.化g.，2013,30:166-171等报道，存在底物浓度低（<50旨/〇，酶用量大（〉 50g/L)，ee值低(95 % )等问题。游离的酬还原酶催化如W0 2008042876等报道，底物浓度低 (13g/U，酶用量高(酬还原酶3.3%，GDH 3.3%，辅酶0.67% )，产物收率低(66.7% )。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工程化酬还原酶多肤及其用于制 备(3R，5S)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋的方法。
[000引为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种工程化酬还原酶多肤，能够W6- 氯-(5S)-径基-3-幾基己酸叔下醋为底物，在适合的条件下将其还原为(3R，5S)-6-氯-3,5- 二径基己酸叔下醋，所述的酬还原酶多肤的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。其中，序 列2为来自化ndida magnoliae的野生型酬还原酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和 活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获得，突变体获得增强的活性和稳定性，可W 通过高通量筛选化TS)等方法探知，上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领 域内的常规技术。
[0009] 本发明提供了一种编码多肤的多核巧酸。优选地，所述的多核巧酸选自序列1、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列，其表达的 蛋白如上文所示。
[0010] 本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控 制序列可操作地连接的多核巧酸。该表达载体为祀T30a。
[0011] 本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯 草芽抱杆菌、地衣芽抱杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆 困。
[0012] 本发明还提供了一种使用上述酬还原酶多肤生物催化制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二 径基己酸叔下醋的方法，所述方法W6-氯-(5S)-径基-3-幾基己酸叔下醋为底物，在适于将 其还原为（3R，5S)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋的反应条件下与上述的酬还原酶多肤接 触。
[0013] 优选地，所述反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0~7.0、溫度为25 °C~30°C的缓冲溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和 葡萄糖脱氨酶。常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氨酶、甲酸和甲酸 脱氨酶、葡萄糖-6-憐酸和葡萄糖-6-憐酸脱氨酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氨酶、亚憐酸和 亚憐酸脱氨酶、分子氨和氨化酶W及电化学等方法。
[0014] 优选地，所述葡萄糖脱氨酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为 EW002的葡萄糖脱氨酶。
[0015] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在制备（3R， 55)-6-氯-3,5-二径基己酸叔下醋过程中，采用了包括来源于〔曰11(11(13 1]1曰即〇11曰0 1尸〇 0705的野生型酬还原酶多肤和及其工程化还原酶多肤的系统酬还原酶，与现有技术相比， 酶用量降低至0.25%，底物浓度提高至lOOg/L，反应时间缩短至6小时，底物转化率99%，具 有重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于W下实施 例。实施例中采用的实施条件可W根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为常规实验中的条件。
[0017] 实施例1(酬还原酶的制备）：
[0018] 采用常规方法制备获得了酬还原酶催化剂:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司 合成，与祀T30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E. CO1 i BL21 (DE3)菌株，筛选 得到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37°C培养至0D600至0.8,加入诱导 剂IPTG，继续培养16小时，离屯、收集沉淀，加入憐酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破碎10 分钟，离屯、取上清，冷冻得到酬还原酶酶粉。
[0019] 实施例2(酬还原酶的筛选）
[0020] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在 大肠杆菌中表达获得的酬还原酶2mg，G畑(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002) 2mg，NADP Img，底物6-氯-(5S)-径基-3-幾基己酸叔下醋50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30°C 1000巧m揽拌，化后取样HPLC检测，序列43的转 化率和ee均为>99%，因此采用序列43作为进一步研究对象。
[0021] 实施例3(酶催化反应）
[0022] 底物6-氯-(5S)-径基-3-幾基己酸叔下醋6g、葡萄糖20g加至装有50mL 50mM pH 6.5的憐酸盐缓冲溶液的lOOmL反应器中，加入由序列43在大肠杆菌中表达获得的酬还原酶 15mg，G畑(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002) 15mg，NADP 3mg，在25°C下，用浓 度为15%的碳酸钢溶液调节控制抑6.0-6.5，揽拌6小时，HPLC/MS检测反应完全，加入等体 积乙酸乙醋过滤后取有机相，水相用等体积乙酸乙醋萃取3次，合并有机相旋蒸获得产物 (3R，5S)-6-氯-3，5-二径基己酸叔下醋的淡黄色液体5.5g，de值99.9%，纯度99.0%。
[0023] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 ±能够了解本发明的内容并据W实施，并不能W此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种工程化酮还原酶多肽，能够以6-氯_(5S)_羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，在适 合的条件下将其还原为(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，其特征在于，所述的酮还原 酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。2. -种编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。4. 一种表达载体，所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作 地连接的权利要求3所述的多核苷酸。5. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。7. -种使用权利要求1中所述的酮还原酶多肽生物催化制备（3R，5S)-6-氯-3,5-二羟 基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，所述方法以6-氯_(5S)_羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底 物，在适于将其还原为(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的反应条件下与权利要求1所 述的酮还原酶多肽接触。8. 根据权利要求7所述的制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特征在 于，所述反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0~7.0、温度为25 °〇30 °C的缓冲 溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。9. 根据权利要求7所述的制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特征在 于，所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱 氢酶。
【文档编号】C12P7/62GK106011094SQ201610596347
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】付敏杰, 张涛
【申请人】苏州汉酶生物技术有限公司