一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
【专利摘要】本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法。所述基因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5. CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5?Donor载体，所述CCR5?Donor质粒载体具有pXL?BACII?L?arm?CAG?TK?PGK?PuroR?T2A?eGFP?bGH pA ?R?arm结构，其中，L?arm和R?arm为左右同源臂，L?arm和R?arm中间的CAG?TK?PGK?PuroR?T2A?eGFP?bGH pA为筛选标记组件；通过两次转染，利用CRISPR?Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。
【专利说明】
-种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
技术领域
[0001] 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体设及一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA 修复的基因无缝编辑方法。
【背景技术】
[0002] 基因编辑技术是人们开启认识基因功能的钥匙，早期研究基因功能主要是通过同 源重组方式进行基因编辑，运种方式过度依赖自然重组，对哺乳动物而言，效率极低，只有 千万分之一，不能够满足人类日益发展的科研需求。随后人们在研究中发现，如果在基因组 DNA祀位点上引入双链断裂(Double Strand Breaks，DSBs)，哺乳动物细胞中相应的同源重 组效率比自发同源重组大大提高，能达到3~5Χ10-2。近年来兴起的Ξ种人工核酸酶:锋指 核酉如每（Zinc finger nuclease s，ZFNs)，TALE核酉《酉每（Transcription activator-like effectornuclease，TALE化），W及CRISPR/Cas9核酸酶技术都可W在DNA祀位点产生DNA双 链断裂，从而可W大大提高基因组编辑的效率。因为CRISPR/Cas9是一种RNA导向的核酸酶 技术，只要改变中间的20bp就可W完成对不同祀位点的切割，现在更是得到了更加广泛的 应用。
[0003] 除此之外，如果在同源臂中间插入筛选标记组件，通过药物筛选还可W大大提高 同源重组的效率。然而，筛选标记组件会遗留在基因组中。筛选标记组件存在于基因组可能 会抑制基因的转录或不需要的基因剪切。利用&e/loxP系统可W将筛选标记组件删除，但 是却留下一个％bp的loxp序列。运个短的序列有可能会影响哺乳动物临近基因的表达。 PiggyBac转座子系统可W毫无痕迹的把筛选标记组件删掉。但是PiggyBac转座子很容易整 合到基因组的其他位点。
[0004] 单链退火修复(SSA)是DNA损伤后修复的一种途径，该途径是DNA双链断裂部位处 于两段方向相同的同源序列之间发生的一种特殊的同源重组修复。损伤部位及同源部分区 域会解链成单链并且相互互补配对结合，运个退火结合可W迅速被进一步加工，即切除单 链尾己并填补裂口，从而删除同源序列中间的片段及一个同源序列。长期W来，人们都认为 非同源末端连接(NHEJ)是哺乳动物DNA断裂后最主要的修复方式，但是如果在断裂的两端 存在重复序列，并且重复序列相邻较近，SSA会成为最主要的修复方式。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明公开了一种利用CRISPR/化s9技术基于SSA修复的基因无缝 编辑方法，所述基因无缝编辑方法两次利用CRISPR/Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机 审IJ，通过细胞的正负向筛选，来达到基因无缝编辑的目的。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 一种利用CRISPR/化s9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法，所述基因无缝编辑 方法首先构建祀向CCR5基因的CCR5. CRISPR/Cas9和祀向eGFP的eGFP. CRISPR/Cas9表达载 体，并构建供体CCR5-Donor载体，所述供体CCR5-Donor载体具有阴kBACII-L-arm-CAG-TK- PGK-Pur〇R-T2A-eGFP-bGH pA-R-arm结构，其中，レarm和R-arm为左右同源臂，karm和R- arm中间的CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP-bGH pA为筛选标记组件；通过两次转染，利用 CRISPR/化s9技术分别打祀CCR5基因和eGFP祀位点W及利用细胞内的皿和SSA修复机制，通 过细胞的正负向筛选，完成无缝编辑。
[000引进一步地，构建供体CCRS-Donor载体具体包括W下步骤：
[0009] (1)筛选标记组件的构建：所述筛选标记组件结构为pBlue-CAG-TK-PGK-Pu;r〇K- T2A-eGFP-bGH pA，其两端具有eGFP的祀位点；
[0010 ] (2)中间载体pXkBAC II -R-armA-arm的构建:将左右同源臂karm和R-arm插入到 pXkBACn载体中，构建得到载体pXkBACII-R-armA-arm，其中，左右同源臂karm和R-arm 之间含有Notl和化〇1酶切位点；
[0011] (3)供体CCR5-Donor载体的构建：将CAG-TK-PGK-化r〇R-T2A-eGFP-bGH pA序列插 入到步骤（2)制备获得的pXkBAC II -R-arm-karm的左右同源臂karm和R-arm之间获得供 体 CCR5-Donor 载体。
[0012] 进一步地，步骤（1)所述筛选标记组件的构建依次包括:载体P113.7-CAG的构建、 载体 P113.7-CAG-TK 的构建、载体化 L3.7-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP 的构建、载体地 lue- CAG-TK-PGK-Pur〇R-T2A-eGFP的构建W及载体pBlue-CAG-TK-PGK-Pur〇R-T2A-eGFP-bGH pA 的构建。
[0013] 进一步地，步骤(2)所述中间载体口乂心1^(：11-1?-曰1'1]1寸-曰1'1]1的构建依次包括：中间 载体 pXkBACIIA-arm 的构建和 pXkBACII-R-armA-arm 的构建。
[0014] 进一步地，步骤(3)所述供体CCR5-Donor载体的构建具体为：用Notl和化〇1分别酶 切中间载体pXレBACII-R-arm-レarmW及筛选标记组件载体pBlue-CAG-TK-PGK-PuroK- T2A-eGFP-bGH pA，获得骨架和插入片段，连接构建，获得载体CCR5-Donor。
[0015] 进一步地，第一次转染利用CCR5.CRISPRA：as9表达载体和供体CCR5.Donor载体打 祀CCR5基因同时进行同源重组，第二次利用eGFP. CRISPR/Cas9表达载体打祀中间的筛选标 记组件。
[0016] 进一步地，所述CCR5祀位点片段为：CATACAGTCAGTATCAATTCTGG;所述GFP祀位点 为：CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG。
[0017] 进一步地，在所述两次转染中，第一次转染加入的CCR5.CRISPR/化s9表达载体和 供体CCR5. Donor载体的分子摩尔数比为1: 1。
[0018] 本发明的有益技术效果：
[0019]本发明提供的一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法，可W 进行阳性细胞克隆的筛选，无缝删除筛选标记组件，达到基因的无缝编辑。
【附图说明】
[0020] 图1为CRISPR/tas9表达载体质粒图谱；
[0021] 图2为CCR5-Donor的质粒图谱；
[0022] 图3为PCR检测同源重组电泳；
[0023] 图4为抗GCV克隆的PCR产物Sa 11酶切结果。
【具体实施方式】
[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0025] 相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修 改、等效方法W及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细 节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有运些细节部分的 描述也可W完全理解本发明。
[00%] 实施例1
[0027] 一种利用CRISPR/化s9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法，所述基因无缝编辑 方法首先构建祀向CCR5基因的CCR5. CRISPR/Cas9和祀向eGFP的eGFP. CRISPR/Cas9表达载 体，并构建供体CCR5-Donor载体，所述供体CCR5-Donor载体具有阴kBACII-L-arm-CAG-TK- PGK-Pur〇R-T2A-eGFP-bGH pA-R-arm结构，其中，レarm和R-arm为左右同源臂，karm和R- arm中间的CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP-bGH pA序列为筛选标记组件结构;通过两次转染， 利用两次CRISPR/Cas9技术分别打祀CCR5基因和eGFP祀位点W及细胞内的皿和SSA修复机 审IJ，通过细胞的正负向筛选，完成无缝编辑。
[0028] 祀向 CCR5 基因的 CCR5.CRISPR/Cas9 和祀向 eGFP 的 eGFP.CRISPR/Cas9 表达载体的 构建：
[0029] WCRISPR/Cas9表达载体的构建为现有技术，构建获得的CRISPR/Cas9表达载体结 构如图1所示。Wpl 13.7-曲NA-Cas9载体为模板，上游引物分别为CCR5-F和eGFP-F，下游引 物都同为R，分另化CR扩增CCR5和eGFP基因的排NA片段。PCR扩增所用引物如表1所示。PCR反 应体系如表2所述，反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸 20s，18个循环，每个循环的退火溫度降rC ;95°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸20s，25个 循环；最后72°C延伸lOmin。
[0030] 用BamM和趾ol双酶切质粒pll3.7-gRNA-化s9即CRISPR/Cas9表达载体作为骨架， 同时用Bsal和化〇1双酶切扩增的gRNA片段，酶切体系见表3,表4。对骨架和gRNA片段胶回收 后，将酶切回收的骨架和PCR片段在16 °C连接1 Oh，连接体系见表5 (连接体系中片段和骨架 的摩尔数比为3:1，两者的质量和为50-150ng)。
[0031] 然后将连接产物转化感受态细菌DH5a，涂含氨节青霉素的LB固体培养基的平板 上，37Γ细菌培养箱培养1化后，用10化的无菌小枪头挑取单克隆，接种在含氨节青霉素 LB 液体培养基中，37 °C摇床中培养12h，10，OOOr/min离屯、收集菌体，根据质粒提取试剂盒说明 书操作步骤提取质粒。获得祀向CCR5基因的CCR5. CRISPR/Cas9和祀向eGFP的eGFP. CRISPR/ 化s9表达载体。
[0032] 表1 PCR扩增引物序列
[0033]
[0034] 注:划线部分是与祀序列互补的DM序列。
[0035] 表2 PCR扩增体系
[0040] 表4曲NA的PCR产物酶切体系
[0045] 构建供体CCRS-Donor载体具体包括W下步骤：
[0046] (1)筛选标记组件载体的构建：所述筛选标记组件结构为pBlue-CAG-TK-PGK- 化r〇R-T2A-eGFP-b細pA;具体包括W下步骤：
[0047] 载体P113.7-CAG的构建：W质粒CAG pamttle(Addgene)为模板，扩增引物为4了6- F与ATG-R，ATG-F为gcggccgc TCGACATTGATTATTGACTAG(NotI)，ATG-R为gaattc AAATGATGAGACAGCACAATAACCAG化coRI)，经过PCR获得CAG片段。PCR反应体系如表6所示，反 应条件为:95°C预变性5min;95°C变性3〇3,68°(：退火3〇3,72°(：延伸2〇3，18个循环，每个循环 的退火溫度降rC;95°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸2〇3,25个循环；最后72°(：延伸 10min〇
[004引表6: CAG片段PCR体系
[0049]
[00加]用Not巧此coRI酶切？113.7^(1(1旨6116)作为骨架，同时用齡1巧此(3〇1?1酶切〔46片 段，P113.7骨架酶切体系W及CAG片段酶切体系(见表7,表8)，胶回收目的片段。将骨架和酶 切回收的CAG片段连接，连接体系见表9。经过16°C过夜后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂 LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37 °C培养化，提质粒，获得载体P113.7- CAGo
[0化1] 表7: P113.7骨架酶切体系
[0化2]
[0053]表8:CAG片段酶切体系
[005引载体P113.7-CAG-TK的构建：W质粒pRkTK(Addgene)为模板，扩增引物为TK-F: GCGggtctc CAATTATGGCCTCGTACCCCG(Nhel)，TK-R: CTAgctagcggatccaccggtGTTAGCCTCCCCCATCTCC(BsaI)，PCR 扩增 ΤΚ 片段。ΤΚ 片段用 Nhel 和 EcoRI酶切，骨架PI 13.7-CAG同时用Nhe巧此coRI酶切。连接，构建载体化L3.7-CAG-TK。其 中，PCR反应体系及反应程序，酶切体系，连接体系都与载体P113.7-CAG的构建过程相同，不 再寶述。
[0059] 载体化L3.7-CAG-TK-PGK-化r〇R-T2A-eGFP的构建：W质粒pCAG-T7-cas9+排NA- P 泌-Pur〇R-T2A-eGFP (购买获得）为模板，扩增引物为 PPTG-F: CTAgctagcCCGGTAGGCGCCAAC eGFP片段。PGK-Pur〇K-T2A-eGFP片段用Nhe巧日EcoRI酶切，同时Nhe巧日EcoRI酶切骨架 P113.7-CAG-TK，构建载体 P113.7-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP。其中，PCR 反应体系及反应 程序，酶切体系，连接体系都与载体P113.7-CAG的构建过程相同，不再寶述。
[0060] 载体 pBlue-CAG-TK-PGK-Pur〇R-T2A-eGFP 的构建：用 Not 巧 PEcoRI 分别酶切 P113.7-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP和pBlueScript II SK( + )获得片段和骨架，连接，构 建载体地lue-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP。其中，PCR反应体系及反应程序，酶切体系，连 接体系都与载体P113.7-CAG的构建过程相同，不再寶述。
[0061 ]载体地lue-CAG-TK-PGK-Pur〇R-T2A-eGFP-b細 pA的构建：WPX330(Addgene)为模 板，WbGH pA-F:aat GAATTC CGACTGTGCCTTCTAGTTGC(EcoRI)和bGH pA-R:aatCTCGAG CCAGCATGCCTGCTATTCTC(趾ol)为引物，扩增片段bGH pA。用EcoRI和趾ol酶切片段bGH pA， 同时用EcoR巧日趾ol酶切pBlue-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP获得骨架，连接，构建载体 pBlue-CAG-TK-PGK-Pur〇K-T2A-eGFP-bGH pA。其中，PCR反应体系及反应程序，酶切体系，连 接体系都与载体P113.7-CAG的构建过程相同，不再寶述。
[0062] (2)中间载体pXL-BAC II -R-arm-L-arm的构建:将左右同源臂karm和R-arm插入到 pXkBACn载体中，构建得到载体pXkBACII-R-armA-arm，其中，左右同源臂karm和R-arm 之间含有No 11和化01酶切位点；具体包括W下步骤：
[00创中间载体pXkBACIIA-arm的构建：W肥K293T的基因组为模板，用引物CCR5A-F: aatggatccCATGGTGCTATAGAGCACAAi 口 CCR5-L-R: aatGCGGCCGCCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGGAAAATGAGAGCTGCAGGTG，扩增长度为 87抓9的心 arm片段。用BamHI和Notl分别酶切pXkBAQKPkarm片段分别作为骨架和片段，连接，构建 载体 PXkBACIIA-arm。
[0064] P化-BACII-R-arm-karm的构建：W皿K293T的基因组为模板，用引物SSA-F:aat CTCGAGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGTCTTACTGTCCCCTTCTGGG和SSA-R: gtcgacTGTATGGAAAATGAGAGCTG扩增重复序列Repeat。同时用引物CCR5-R-F: TCATTTTCCATACAgtcgacTTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTG和CCR5-R-R: aatAAGCTTCTCAAGAATCAGCAATTCTCTG，PCR 扩增 R-arm-P。
[00化]W上述扩增的Repeat和R-arm-P为模板，用引物SSA-F和CCR5-R-R扩增R-arm。用 Hindlll和趾〇1分别酶切pXkBACII-karm和R-arm片段分别作为骨架和片段，连接构建载 体 pXkBAC II -R-armA-arm。
[0066] (3)供体CCR5-Donor载体的构建：将CAG-TK-PGK-化r〇R-T2A-eGFP-bGH pA序列插 入到步骤（2)制备获得的pXkBAC II -R-arm-karm的左右同源臂karm和R-arm之间获得供 体 CCR5-Donor 载体。
[0067] 所述供体CCR5-Donor载体的构建具体为：用Not巧日趾〇1分别酶切中间载体pXレ BACII-R-arm-karmW及筛选标记组件载体pBlue-CAG-TK-PGK-化r〇R-T2A-eGFP-b細 pA， 获得骨架和插入片段，连接构建，获得载体CCR5-Donor (如图2所示）。
[0068] W下W肥K293T细胞的CCR5基因的无缝编辑为例进行说明，无缝编辑具体步骤：
[0069] 1.第一次转染
[0070] 将肥K 293T细胞系置于含DMEM，10%胎牛血清，lOOyg/mL青链霉素的培养基中，37 °C，5%的C02培养箱培养。
[0071] 肥K 293T细胞系的转染：W24孔板为例，接种肥K 293T细胞至24孔板中，待细胞密 度接近70%时，换新鲜培养基。吸出24孔板中的培养基，每孔加入37Γ预热的新鲜培养基 500化，2-4小时后开始转染。取两个1.5mL灭菌EP管，一个加入约1.化g (CCR5. sgRNA/化s9与 CCR5-Donor分子摩尔数比为1:1)的质粒，然后加入化ti-MEM至总体积30化;另一个EP管内 加入化L So-Fast转染试剂和化ti-MEM至30化。轻轻混匀两个EP管内的混合物，然后将含转 染试剂的Opti-MEM缓慢加入含质粒的EP管中，边加边轻轻震荡，使其充分混匀。加完混匀 后，将混合物置于室溫20min，然后将一个转染混合体系滴加至一个24孔中，轻轻晃动几下， 将培养板放回培养箱，12小时后换新鲜培养基。
[0072] 2.抗嚷岭霉素阳性细胞的筛选
[0073] 转染4她后，培养基中加入3ug/mL的嚷岭霉素(Puromycin)，持续7天，每天更换培 养基，细胞长出单克隆，挑选发绿光的20个单克隆进行扩大培养。
[0074] 3.抗嚷岭霉素阳性细胞的PCR检测
[0075] 将挑选的单克隆扩大培养后，一半提基因组进行PCR检测。PCR扩增引物为P1/P2， P3/P4和Pl/P3(如表10所示）。引物P1和P3分别在左右同源臂外侧的基因组上，P2在筛选标 记组件TK基因的启动子CAG上，P4在筛选标记组件eGFP基因的多聚A尾上。所WP1/P2能扩增 出1.0肺的片段说明CCR5基因和Dnoor的左同源臂发生了同源重组，P3/P4能扩增出约1.5肺 的片段，说明CCR5基因和Donor的右同源臂发生了同源重组，反之，则没有同源重组；如果 P1/P3用TouchDown程序，退火时间设为2min，扩增出1.9肺的片段，则说明没有发生同源重 组。PCR检测同源重组电泳结果如图3所示，20个单克隆的PCR都能扩增出相应的条带，说明 20个克隆的左右同源臂都正确的插入到了CCR5基因的特点位点，但都是单等位基因的突变 测序结果进一步表明CCR5. Donor载体定点同源重组到CCR5基因。
[0076] 表10:PCR检测用引物
[0077]
[0078] 4.第二次转染
[0079] 挑选同源重组的克隆2和10,培养于24孔板中。当细胞密度为70%时，进行转染。转 染质粒为lug的eGFP.sgRNA/tas9。细胞培养及转染过程与第一次转染相同，运里不再寶述。
[0080] 5.抗GCV阳性细胞的筛选
[0081 ] 转染4她后，培养基中加入3ug/mL的更昔洛韦（ganciclovir,GCV)，持续10天，每天 更换培养基，细胞长出单克隆，挑选不发绿光的48个单克隆进行扩大培养。
[0082] 6.抗GCV阳性细胞的PCR产物酶切检测
[0083] 将挑选的单克隆扩大培养后，提基因组进行PCR产物的酶切检测。PCR扩增引物为 P1/P3dPCR扩增产物用Sail酶切检测。挑选的48个克隆中，1个克隆的PCR产物能被Sail酶切 开。其酶切结果如图4所示，并测序结果进一步表明CCR5基因的32bp无缝编辑为Sail酶切位 点。
[0084] 当通过核酸酶技术在基因组DNA中引入双链断裂(Double strand break,DSB)后， 细胞主要通过非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复。针对编码基因 采用NHEJ机制修复有2Λ的概率实现目标基因的移码突变"敲除"，但是NHEJ修复的结果具 有不可控性，并不能实现目标基因的精确编辑;采用同源依赖性修复化omology-directed repair,皿R)机制，借助于供体DNA的同源重组效应能够实现目标基因的精确编辑，但是仍 存在着HDR重组效率低、阳性细胞克隆筛选困难(针对供体DNA不含筛选标记的情况）。为了 提高精确编辑的效率，传统技术中，在供体Donor左右同源臂之间插入筛选标记组件，通过 药物的筛选来富集基因编辑的细胞，但是却将筛选标记组件留在了基因组上。为了去掉运 个筛选标记组件，人们通常利用Cre/loxP系统来进行同源重组，得到编辑的细胞后再次将 细胞通过转入化e/loxP重组酶来将筛选标记组件去掉，但该系统却在基因组上留下34bp的 LoxP序列。PB转座子可W将筛选标记组件去掉而将基因组进行精确编辑，但是PB转座子却 很容易"跳跃'到基因组的其他位置。利用CRISPR/化s9两步敲除基于皿和SSA机制进行的基 因无缝编辑方法可W进行阳性细胞克隆的筛选，无缝删除筛选标记组件，达到基因的无缝 编辑。
【主权项】
1. 一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法，其特征在于，所述基 因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5基因的CCR5.CRISPR/Cas9和靶向eGFP的eGFP.CRISPR/ Cas9表达载体，并构建供体CCR5-Donor载体，所述供体CCR5-Donor载体具有pXL-BACII-L-arm-CAG-TK-PGK-Puro R-T2A-eGFP-bGH pA -R-arm结构，其中，L-arm和R-arm为左右同源 臂，L-arm和R-arm中间的CAG-TK-PGK-Puro R-T2A-eGFP-bGH pA为筛选标记组件;通过两次 转染，利用CRI SPR/Cas9技术分别打靶CCR5基因和eGFP靶位点以及利用细胞内的HR和SSA修 复机制，通过细胞的正负向筛选，完成无缝编辑。2. 根据权利要求1所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，构建供体CCR5-Donor载体具体包括以下步骤： (1) 筛选标记组件的构建：所述筛选标记组件结构为pBlue-CAG-TK-PGK-PuroR-T2A-eGFP-bGH pA，其两端具有eGFP的靶位点； (2) 中间载体pXL-BACII-R-arm-L-arm的构建：将左右同源臂L-arm和R-arm插入到pXL-BACII载体中，构建得到载体pXL-BACII-R-arm-L-arm，其中，左右同源臂L-arm和R-arm之间 含有Notl和Xho頂每切位点； (3) 供体CCR5-Donor载体的构建:将CAG-TK-PGK-PuroR-T2A-eGFP-bGH pA序列插入到步 骤(2 )制备获得的pXL-BACII-R-arm-L-arm的左右同源臂L-arm和R-arm之间获得供体CCR5-Donor载体。3. 根据权利要求2所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，步骤（1)所述筛选标记组件的构建依次包括:载体P113.7-CAG的构建、载体 P113 · 7-CAG-TK 的构建、载体 PLL3 · 7-CAG-TK-PGK-Pur〇-T2A-eGFP 的构建、载体 pBlue-CAG-TK-PGK-PuroR-T2A-eGFP的构建以及载体pBlue-CAG-TK-PGK-Puro R-T2A-eGFP-bGH pA的构 建。4. 根据权利要求2所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，步骤（2)所述中间载体pXL-BACII-R-arm-L-arm的构建依次包括：中间载体 pXL-BACII- L-arm的构建和pXL-BACII-R-arm-L-arm的构建。5. 根据权利要求2所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，步骤(3)所述供体CCR5-Donor载体的构建具体为：用Notl和Xhol分别酶切中间 载体 pXL-BACII-R-arm-L-arm 以及筛选标记组件载体 pBlue-CAG-TK-PGK-PuroR-T2A-eGFP-bGH pA，获得骨架和插入片段，连接构建，获得载体CCR5-Donor。6. 根据权利要求1所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，第一次转染利用CCR5. CRI SPR/Cas9表达载体和供体CCR5. Donor载体打靶CCR5 基因同时进行同源重组，第二次利用eGFP. CRISPR/Cas9表达载体打靶中间的筛选标记组 件。7. 根据权利要求6所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，所述CCR5靶位点片段为:CATACAGTCAGTATCAATTCTGG ;所述eGFP靶位点为： CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG 〇8. 根据权利要求6所述一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法， 其特征在于，在所述两次转染中，第一次转染加入的CCR5 . CRISPR/Cas9表达载体和供体 CCR5.Donor载体的分子摩尔数比为1: 1。
【文档编号】C12N15/85GK106011171SQ201610333062
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】张智英, 白义春, 徐坤, 魏泽辉, 和林洁, 任充华, 邵斯旻, 吴芸, 刘中天
【申请人】西北农林科技大学