利用5’?瓣状内切核酸酶活性被抑制的dna聚合酶并通过实时聚合酶链反应来检测突变基 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在PCR产物的末端上互补结合探针的情况下，利用抑制DNA聚合酶的5'?瓣状内切核酸酶(FEN)活性的特性来检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。更具体地涉及将实时聚合酶链反应(real?time PCR)中使用的探针与PCR产物末端进行互补结合的情况下，确认抑制针对探针的耐热性DNA聚合酶的5'?瓣状内切核酸酶活性的特性，并利用其特性来使待检测的单核苷酸多态性(SNP)部位位于探针的5'?末端部位时，根据等位基因(allele)来诱导5'?瓣状的形成，从而可有效地检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。
【专利说明】
利用5'-瓣状内切核酸酶活性被抑制的DNA聚合酶并通过实时 聚合酶链反应来检测突变基因的方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及利用实时聚合酶链反应(real-time PCR，RT-PCR)来检测DNA突变的方 法。更具体地涉及抑制DNA聚合酶、具体为家族A DNA聚合酶、更具体为Taq DNA聚合酶的5'_ FEN(5 '-flap endonuclease;以下，与"FEN"混用）活性的方法、利用被抑制的FEN活性来检 测单核苷酸多态性（single point nucleotide polymorphisms，以下SNP)等基因突变的方 法、基因突变检测用探针的设计方法及针对多种探针类型的适用方法等能够有效而精确地 检测基因突变的新颖而有效的方法。
【背景技术】
[0002] 基因的突变分析在人遗传疾病诊断、药物遗传学、药物开发以及微生物学等多种 科学领域中的重要性再次被强调，是个快速成长的领域。在遗传学领域中，突变是指构成 DNA的碱基序列的变化，作为易位、倒位，包含特定基因的插入/缺失和单核苷酸多态性 (SNP)。其中，SNP是最常规形态的DNA碱基序列的变化，就人基因而言，按每1000个碱基出现 一个（Sachidanandam，R· et al · 2001 .Nature ,409:928-933)。在人基因体中，SNP比编码部 位（coding regions)更频繁出现在非编码部位（non-coding regions)(LI，W.H.and Sadler, L.A. 1991.Genetics, 129:513-523)，非编码部位的SNP在进化的研究中用作分子标 记物，由于编码部位的SNP对基因的功能、蛋白质的结构或表达带来影响，因此用作遗传疾 病研究及诊断的标记物（Kim, S.and Misra，Α· 2007 .Annu.Rev·Biomed.Eng.，9:289-320) 〇 如此地开发出利用分子标记物以高的可靠性和灵敏度来快速而经济地分析SNP的多种方法 (Syvanen,A.C.2001.Nat.Rev.Genet.,2：93〇-942；Kirk,B-W-et al.2002.Nucleic acids Res·，30:3295-3311;Kwok,P_Y.，2002.Hum.Mutat·，19:315-323)〇
[0003] 利用RT-PCR的SNP分析方法是最广泛利用的方法随着可利用的遗传信息丰富，其 应用度也越高，与其他SNP分析法相比，RT-PCR具有快速而灵敏度和特异度高，且分析费用 低廉，而且容易进行自动化的优点。况且，与以往的常规PCR (con vent i ona 1 PCR)不同的是， RT-PCR无需利用琼脂糖凝胶来进行电泳分析，因此还具有可使对污染的错误分析最小化的 优点。
[0004] 为了利用RT-PCR来分析SNP，利用寡核苷酸形态的探针或引物，主要使用杂交探针 (hybridization probe)、水解探针（hydrolysis probe或TaqMan probe)、分子信标 (molecular beacons)以及蝎形引物（scorpion primers)方法等。利用杂交探针的突变分 析方法商用化了使用将焚光共振能量转移(fluorescent resonance energy transfer; FRET)作为原理的Roche公司的LightCycler PCR system的方法（Wittwer，C.T.et al·， 1997. BioTechniques, 22:176-181)。分析中使用两种探针，FRET利用了当两个探针与靶DNA 相邻而杂交结合时产生荧光的原理。利用杂交探针的突变分析，结束PCR之后分析解链曲线 (melting curve)，由此可利用杂交探针来进行突变分析。即，因突变而导致革E1序列的部分 序列与探针序列不一致的情况与完全一致的情况相比解链温度更低，因此在解链曲线的样 态上出现差异(Lohmann，S.，et al · ,2000.Biochemica，4:23-28)。利用杂交探针和解链曲 线来分析突变的方法是十分快速的分析方法，探针设计也相对来说容易。但是，实质上解链 曲线始终未呈现预期的突变解读能力。
[0005] 水解探针方法在PCR反应时一同使用引物和两个末端上结合有报道颜料 (reporter)和猝灭颜料(quencher)的探针，并利用焚光共振能量转移原理。即为如下原理， 报道颜料和猝灭颜料相邻时，从报道颜料释放的能量向邻接的猝灭颜料转移，荧光未被检 测，随着PCR扩增产物增加，与靶基因相结合的探针被Taq DNA聚合酶的5 '-3 '核酸酶活性 分解的同时散发出报道颜料的焚光。水解探针分析方法(TaqMan probe assay)中，找出可 将探针与靶碱基序列相结合，并将探针被核酸酶活性分解的最佳条件尤为重要。即，在PCR 中使用的引物和探针与靶序列进行杂交结合的同时可分解探针的PCR条件（thermal profile)十分重要。为了满足以上两种要求条件，通常适用2级PCR。即，在95°C的温度下进 行变性（(^的1：11^1:;[011)步骤，在比探针的1'1]1更低7~10 <€的60<€的温度下同时进行退火 (anneal ing)和延长（extension)。若在过高的温度下进行反应，则探针从祀子分离 (strand-displace)，而不是被Taq DNA聚合酶分解，焚光未被增加（Logan，J.et al. 2009. Caister Academic Press) JaqMan?探针具有使用多种焚光物质可进行SNP检测 或突变分析的优点。但是，在该方法中，为了赋予探针的特异度，需要使用短的探针，因此Tm 值必然降低，导致难以维持稳定的退火状态。因此具有为了克服这个问题而需要使用昂贵 的小沟结合(MGB，Miner Groove Binder)探针或锁核酸（LNA，Locked Nucleic Acid)探针 的缺点（Letertre，C.et al.2003.Mol.Cell Probes.ndOT-SllhMGB TaqMan探针与常规 TaqMan探针类似，但区别在于3'末端上追加小沟结合部分，因此即使探针长度较短，Tm也会 高，由此在PCR条件下维持稳定的退火状态(Kutyavin，I · V. et al · 2000 .Nucleic Acids Res.，28:655-661)。还可以不像MGB-样使用额外的变性探针，而与TaqMan探针一同利用扩 增受阻突变系统(AMRS，Amplification Refractory Mutation System)PCR原理来分析SNP (Ellison，G.et al.2010.J.Exp.Clin.Cancer Res. ,29:132)。但是，ARMS PCR找出可区分 SNP的最佳PCR条件十分苛刻（Punia P · and SAunders ·N· http: //www·horizonpress · com/ pcrbooks)〇
[0006] 分子信标(Molecular beacon)和蝎形引物(Scorpion primer)是包含莖环(stem-loop)结构的结构化的探针(structured probes)，呈现出比杂交探针或TaqMan探针等线性 探针相对高的特异度，而且错配识别能力突出，因此适合于类似的序列的区别或SNP和等位 基因的区分。但是，由于设计环结构的探针十分苛刻，因此难以确保通常制作多种探针做实 验后获得所目的的结构的探针（Bonnet，G.，et al· 1999. Proc. Natl .Acad. Sci. USA ,96: 6171-6176；Broude,N.E.2002.Trends Biotechnol.,20；249-256.；Tapp,I.et al·2000·Biotechniques，28:732-738)。
[0007] 最为代表性的实时聚合酶反应法是作为水解探针方式的TaqMan分析方法，适用于 此的基本原理在于利用Taq DNA聚合酶持有的5'-3'外切核酸酶活性。1991年，荷兰 (Holland)等提出了使用具有与模板DNA互补的碱基序列的探针时，借助Taq DNA聚合酶的 5'-3'外切核酸酶活性可实时确认特定PCR反应。并且，确认到此时使用的探针来说，不管 是与模板DNA具有100%互补性的探针，还是具有5'-末端的非互补瓣状(flap)部位的探针 都无需区分地被Taq DNA的5' - 3'外切核酸酶活性分解（Holland P.M.et al.， 1991. Proc. Nat 1. Acad. Sci .，88:7276-7280)。之后，基于该方法，开发出利用由荧光颜料修 饰的探针的多种RT-PCR方法，广泛应用于多种领域（Heid，C.A.et al · ,1996 .Genome Res·6·986-994.;Livak K.J.1999.Genet.Anal·，14:143-149)〇
[0008]众所周知，通常而言，真核生物(eukarya)和古细菌类(archaea)已区分了被称作 为DNA聚合酶和FEN1 核酸酶(Lieber，M.R.，1997.BioEssays 19:233-240)的DNA内切核酸酶 IV，瓣状内切核酸酶1(FEN1)起到用于去除DNA的复制和修复过程中生成的5'-瓣状的重要 作用（Rossi，M. L · et al ·，Chem. Rev · 106，453-473，Kim，K. et al·，1998 .J.Biol. Chem.， 273:8842-8848: Klungland，A · and Lindahl，T · 1997 · EMBO J · 16:3341-3348)。尤其是，真核 生物的FEN与癌症、病毒性疾病的进行等相关联，因此为了开发新药，FEN尤其是FEN-1的活 性抑制剂备受很大瞩目（McWhirter C· et al · 2013 · J·biomol · Screen· 18:567-75)。
[0009] 与此相反，就包含来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(Taq)的 原核生物家族A聚合酶而言，一个蛋白质内的5 核酸酶和DNA聚合酶存在于不同的区域， 5 核酸酶同时具有5 '-3 '外切核酸酶活性和去除5 瓣状的内切核酸酶（FEN)活性 (Lyamichev,V.et al.1993.Science,260：778-783)〇
[0010] 由上述提及的Holland等的实验结果可知，使用的探针的5'-末端上存在瓣状部位 时，基于FEN活性，而不是基于Taq DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。但是，使用TaqMan 探针的以往方法中，不区分5 '-3 '外切核酸酶和FEN活性，而统称使用5 核酸酶。2005年发 表过的侵染检测（Invader assay)(01ivier M.，2005.Mutat.Res. ,573:103-110)虽然揭不 了可利用热稳定性(thermostabl e )FEN酶的特性来检测SNP的方法，但由于受到不是旋转信 号扩增而是等温（isothermal)影响而导致的低的灵敏度，不能广泛应用。
【发明内容】
[0011] 技术问题
[0012] 虽然如上所述的多种分子诊断技术等已被开发，但依然需要开发具有充足的灵敏 度和特异性的分子诊断技术。尤其是，虽然应用着用于有效检测基因突变的多种方法，但目 前尚未存在均可满足检测时间、费用、特异度及多种检测等实际临床中需要解决的问题的 检测法。
[0013] TaqMan探针等多种方法为了区分SNP，在特定温度下将等位基因特异性(allele-specific)探针的互补结合作为基本原理来使用。由于这种方法单纯利用基于温度的探针 的互补结合力差异，为了使结合力差异变得极大化，产生MGB变形、PNA使用等追加费用。并 且，基于温度的区分性在同时分析多种SNP时，无法确保所有种类探针的特异性。
[0014] 在本发明中虽然使用基于RT-PCR的等位基因特异性探针，但没有追加变形，利用 酶的特异性而不是基于温度的区分性，从而揭示无追加费用地具有检测特异性及多种分析 优点的新检测方法。
[0015]技术方案
[0016]为此，本发明人以目前普遍使用的RT-PCR为基准来使用，并设计成要检测的单核 苷酸多态性(SNP)部位位于探针的5'-末端部位上，来诱导根据等位基因形成的5'-末端非 互补性瓣状，若抑制用于去除原核生物的DNA聚合酶，代表性的Taq DNA聚合酶持有的5'-末 端的非互补性瓣状的FEN活性，则可有效地检测单核苷酸多态性（SNP)的新检测方法，从而 完成本发明。
[0017]本发明人导出可抑制原核生物的DNA聚合酶，代表性的Taq DNA聚合酶的FEN活性 的新方法，并适用该原理，来提供能够将探针的等位基因（allele)的特异性结合和非特异 性结合按Taq DNA聚合酶的特性来区分而不是按特定温度来区分的方法。
[0018] 本发明提供适合于包括Taq DNA聚合酶在内的原核生物的DNA聚合酶的FEN特异性 的探针设计方法。
[0019] 并且，本发明提供不仅使用TaqMan探针等多种荧光探针还使用利用SYBR Green的 非荧光探针，由此可低廉地检测SNP的方法。
[0020] 有益效果
[0021] 根据本发明，提供快速而灵敏度和特异度优秀的适用新原理的经济性基因突变检 测单元。
[0022] 根据本发明的方法，杂交结合时使用探针的5'_瓣状结构的碱基没有或者一个的 探针的情况下，生成PCR扩增产物，与此相反，5'-瓣状结构为2碱基以上的情况下，不生成 PCR扩增产物。
[0023] 利用本发明的实时聚合酶链反应的基因突变检测方法还可适用于以下部分:使用 5 末端上结合有猝灭颜料，3 末端上结合有报道颜料的双链引物，或者利用将颜料插入 双链或者附着于双链表面而不是将颜料结合于引物的表面粘合剂等以往实时PCR中使用的 引物和探针。
[0024] 并且，本发明的方法中，以往广泛利用的TaqMan探针位于PCR扩增产物的5'末端部 位时可有效适。
[0025]而且，以往方法同时分析多种DNA时，利用探针的退火温度差，而本发明的方法利 用了酶的反应特异性，因此能够不受退火温度地对多种SNP进行分型(typing)。
【附图说明】
[0026]图la、图lb表示说明NST探针系统的作用机制的示意图。探针的位置位于PCR产物 的末端，探针的5'_末端具有被等位基因诱导的瓣状结构，这种情况下，Taq DNA聚合酶的 FEN活性被抑制，由此可进行SNP分型（typing)。
[0027]图2表示利用双链引物的RT-PCR的基本示意图及反应结果。
[0028]图3a至图3d表示用于测定利用双链引物的Taq DNA聚合酶的FEN活性的示意图及 RT-PCR 结果。
[0029] 图4a、图4b表示针对NSTS/dsp探针、NSTS/SYBR-green探针的FEN活性度测定结果， 并表示多种探针形态可利用于NST探针系统。
[0030] 图5a、图5b表示针对NSTS/taqman探针及TaqMan探针的FEN活性度测定结果，并表 示TaqMan探针位于PCR产物的末端部位的情况下也可利用于NST探针系统。
[0031 ]图6a至图6d表示为了对NSTS/sybr-green系统起到作用的探针位置的界限进行试 验，调节引物的长度，来确认Taq DNA聚合酶的FEN活性被抑制的实验结果。
[0032]图7a至图7d表示为了对NSTS/taqman系统起到作用的探针位置的界限进行试验， 调节引物的长度，来确认Taq DNA聚合酶的FEN活性被抑制的实验结果。
[0033]图8a至图8d表示确认可适用于NST探针系统的探针的5'-末端结构的结果。
[0034]图9a至图9c表示确认到多种探针对可有效地利用于SNP分型的结果。
[0035] 图10表示针对以ADNA为模板任意选择的5种NSTS/sybr-green探针对的RT-PCR结 果。并表示能给不受探针的互补结合温度影响地同时使用多种探针的NST探针系统的优点。 [0036]图11表示"NST探针系统"与以往"TaqMan探针系统"不同地根据Taq DNA聚合酶的 5'_核酸酶活性特异度来区分探针而不是根据温度差来区分探针，因此与以往方法相比具 有特异度高且对多种SNP分型具有优点的示意图。
【具体实施方式】
[0037]本发明涉及抑制包含5'-瓣状内切核酸酶活性的DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸 酶活性并通过实时聚合酶链反应检测突变基因的方法。
[0038]并且，本发明涉及利用5'-瓣状内切核酸酶活性被抑制或去除的DNA聚合酶来检测 突变基因的方法，其特征在于，上述DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。
[0039]在本发明中利用的耐热性DNA聚合酶不受特别限制，具体可列举水生栖热菌 (Thermus aquat i cus)、嗜热栖热菌（Thermus thermophi lus )、黄栖热菌（Thermus flavus )、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bac i 1 lus stearothermophi lus )、古股纳斯热球菌 (Thermococcus gorgonarius)、极端嗜热细菌（Thermococcus litoralis)、超嗜热原始菌 K0D1 (Thermococcus kodakaraensis K0D1)、沃氏热球菌（Pyrococcus woesei)、激烈热球 菌（Pyrococcus furiosus)、敏捷气热菌（Aeropyrum pernix)、风产液菌（Aquifex aeolicus)、硫化叶菌（Sulfolobus tokodaii)、延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)、坎 氏甲烧嗜热菌(Methanopyrus kandleri)来源的耐热性DNA聚合酶或Ultra DNA聚合酶等的 野生型或来源于其的变异型耐热性DNA聚合酶。耐热性DNA聚合酶包括通过遗传工程人工合 成的耐热性DNA聚合酶。
[0040] 在本发明中，5'-瓣状内切核酸酶活性的抑制或去除使探针及引物位于适当的位 置，从而可通过如下方法来实现这个目的：抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性的方法;通 过DNA聚合酶的变异来抑制或去除5 瓣状内切核酸酶活性的方法;添加5 瓣状内切核酸 酶活性抑制剂的方法;调节对5 瓣状内切核酸酶活性带来影响的其他反应条件，例如盐离 子浓度等的方法。
[0041] 在这种方法的本发明的实施例中，具体地揭示了通过适当定位探针及引物抑制 5瓣状内切核酸酶活性的方法可实现本发明的目的。
[0042] 并且，本发明涉及利用DNA聚合酶来检测突变基因的方法，其特征在于，上述5'-瓣 状内切核酸酶使扩增用前方引物5'_末端和检测用探针的5'-末端位于24-38碱基以内，来 抑制5 瓣状内切核酸酶活性。
[0043]并且，本发明涉及利用DNA聚合酶来检测突变基因的方法，其特征在于，上述检测 用探针为在5 末端具有瓣状部位的探针。
[0044] 并且，本发明涉及利用DNA聚合酶来检测突变基因的方法，其特征在于，上述检测 用探针的5'-末端具有1碱基以上的连续激发结构或非连续激发结构。
[0045] 并且，本发明的特征在于，上述突变基因表示单核苷酸多态性(SNP)、1碱基以上的 缺失、置换及插入中的一种以上。
[0046] 并且，本发明涉及通过利用包含5 瓣状内切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合 酶链反应来检测突变基因的方法，其为利用抑制DNA聚合酶中的5 瓣状内切核酸酶活性的 探针来检测突变基因的方法。
[0047]并且，本发明涉及利用抑制DNA聚合酶中的5 瓣状内切核酸酶活性的探针来检测 突变基因的方法，其特征在于，上述基因突变部位位于探针的5 末端。
[0048]并且，本发明的特征在于，上述突变基因表示单核苷酸多态性(SNP)、1碱基以上的 缺失、置换及插入中的一种以上。
[0049] 并且，本发明的特征在于，上述探针根据等位基因，诱导DNA聚合酶的5'-瓣状内切 核酸酶活性被抑制的5 末端瓣状结构。
[0050] 并且，本发明的特征在于，用于诱导上述DNA聚合酶的5 瓣状内切核酸酶活性被 抑制的5 末端瓣状结构的探针为具有一个5 瓣状碱基的结构、具有两个5 瓣状碱基的 结构或非连续激发结构，且为具有两个5'-瓣状碱基，一个末端碱基为匹配的结构Mis+3 (1)〇
[0051] 并且，本发明的特征在于，1碱基以上的缺失、置换及插入中的一种以上的突变部 位位于DNA聚合酶的FEN活性被抑制的探针的5 ' -末端。
[0052] 并且，本发明涉及基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其为基因突变检测 用聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，包含试样DNA、双链前方引物、双链后方引物、探针及 耐热性DNA聚合酶，上述探针抑制DNA聚合酶的FEN活性。
[0053] 并且，本发明涉及基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，上述探 针为报道颜料和猝灭颜料同时被修饰的双标记探针或非修饰探针。
[0054] 并且，本发明涉及基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，上述双 链前方引物及双链后方引物分别包含互补结合序列，探针为报道颜料和猝灭颜料同时被修 饰的双标记探针。
[0055] 并且，本发明涉及基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，使用上 述非修饰探针的情况下，追加与DNA双键相结合的插入剂（intercalating agents)或表面 粘合剂（surface binding agents)。
[0056] 本发明开发出能够有效检测SNP等突变DNA的方法，临床上用于遗传疾病检测、月中 瘤相关基因检测等。
[0057] 本发明的特征在于，由为了实时PCR而所需的与一对引物和两个引物中的一个部 分互补的碱基序列组成，利用如靶基因碱基序列的探针以及具有5'-核酸酶活性的DNA聚合 酶来检测突变。
[0058]本发明人发现了识别5'-瓣状结构来分解的Taq DNA聚合酶的瓣状内切核酸酶 (Flap endonuclease ;FEN)活性能力根据PCR时杂交结合的探针位置而不同（图la)。由此可 发明利用DNA聚合酶的核酸酶活性的新概念SNP检测方法（图lb)。
[0059] 在本发明中，术语"NSTS(Novel SNP Typing System)"是指利用DNA聚合酶的核酸 酶活性的特异度的本发明的新SNP检测用系统。具体意味着根据探针与靶碱基序列杂交结 合后形成的探针的5'末端结构，DNA聚合酶的核酸酶活性会不同，利用此现象可区别SNP等 基因突变的新检测系统。
[0060] 在本发明中，术语"TaqMan探针"是指两个末端结合有可起到报道和猝灭功能的荧 光物质的变性寡核苷酸。具体地，报道颜料可利用FAM，猝灭颜料可利用TAMRA，但并不局限 于此。
[0061 ]在本发明中，术语"NSTS/dsp"统称使用了在NSTS适用双链引物的探针的情况， NSTS/taqman统称在NSTS使用TaqMan探针的情况。并且"NSTS/sybr-green"统称在NSTS使用 SYBR GREEN系统的情况。
[0062]在本发明中，识另U5 '-瓣状结构而被水解的DNA聚合酶的FEN活性可根据PCR时杂交 结合的探针的位置而不同（图1)。具体地，杂交结合时，具有5 瓣状结构的探针位于PCR扩 增产物的末端，DNA聚合酶的FEN活性受限，探针不分解。更具体地，杂交结合时，使用具有探 针的5'-瓣状碱基为0个的结构的探针（以下Mis+Ο)及具有1碱基结构的探针（以下Mis+Ι)的 情况下，产生PCR扩增产物，与此相反，使用具有5'-瓣状碱基为2碱基的结构的探针（以下 Mis+2)及具有3碱基结构的探针（以下Mis+3)的情况下，DNA聚合酶的FEN活性受限，不产生 PCR扩增产物（图3a至图3d)。
[0063] 在本发明中可适用的引物和探针类型里有利用DSP(double stranded primer)系 统的NSTS/dsp(图4a)和利用适用SYBR Green原理的非修饰引物及探针的NSTS/sybr-green (图4b)等使用于以往实时PCR的引物和探针。上述DSP(double stranded primer)系统使用 引物的5-末端结合有起到猝灭功能的荧光物质，探针的3-末端结合有起到报道功能的荧光 物质的变性寡核苷酸。
[0064] 并且，就以往广泛应用的TaqMan探针系统而言，探针的5'-瓣状部位为2碱基以上 时，Taq DNA聚合酶的FEN活性未被抑制（图5b)，就将TaqMan探针适用于PCR产物的末端位置 的NSTS/taqman而言，探针的5 瓣状部位为2碱基以上时，Taq DNA聚合酶的FEN活性被抑 制，PCR扩增产物未生成（图5a)，就TaqMan探针而言，探针位于PCR产物的末端部位时，可有 效地适用。
[0065]在本发明中，DNA聚合酶的FEN活性被抑制的条件之一的探针的PCR产物内末端位 置中，从探针的5'-瓣状部位到PCR产物的5-末端位置为止可被限定为28至34碱基内来使用 (图6a至图6d，图7a至图7d)，但并不局限于此。
[0066]并且，在本发明中提供用来检测特定SNP点的NSTS探针对的5 末端部位的结构。 [0067] 并且，在本发明中，通过利用NSTS/sybr-green来检测多种SNP部位和适合于此的 NSTS 探针对的适用与否，由此可知 Mis+l/Mis+2(图 9a)、Mis+3(2)/Mis+3(l)(图9b)或 Mis+2 (l)/Mis+2(图9c)对的探针可有效使用于SNP分型。但是，并不局限于这种5'-末端结构，探 针的使用并不受限。
[0068] 本发明提供可同时克服以往方法具有的多种分析及温度敏感性的界限的新SNP分 型方法，其特征在于，根据探针的互补结合温度差来区分探针。
[0069] 在本发明中，对任选的8种NSTS/sybr-green用探针对同时进行RT-PCR，由此可确 认这些探针对可同时有效使用于SNP分型（图10)。并且，在其他退火温度（10°C差）下对同样 的8种探针对进行RT-PCR的结果（图10)也如同上述，可知本发明的SNP分型方法不受退火温 度的影响，可利用酶的反应特异性来区分多种探针对，由此确认到可同时有效地对多种SNP 进行分型（图11)。
[0070] 以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅作为更具体地说明本发明，本 发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显 而易见的。
[0071] DNA试样的准备
[0072] 将ADNA(Catalog#N3011S，New England BioLabs公司）用作PCR用模板DNAJDNA利 用灭菌蒸馏水进行稀释来准备l〇〇pg/ul。如此准备的DNA冷冻保管，以备用于实验。
[0073] 引物及探针的制造
[0074]以对ADNA的特定基因部位进行PCR扩增的方式设计引物，并设计探针使其具有可 与扩增产物进行杂交结合的碱基序列。为了适用荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理，使用了结合有焚光物质的引物和探针。设计的引 物及探针利用本
【申请人】(株)吉诺思的寡核苷酸合成系统。
[0075] RT-PCR反应及确认
[0076]将上述准备好的XDNA试样用作模板，利用准备好的引物及探针来进行实时聚合酶 链反应。使用的引物和探针记载于各实施例。本实施例中使用的聚合酶及反应组合物使用 了3.1X qPCRMix(31mM Tris、pH 9.0,4.65mM MgCh、124mM KCl、620mM甲基葡萄糖、3.1mM dNTPs、3.1u Taq DNA聚合酶，（株）吉诺思，韩国）。利用ABI7500实时PCR系统(ABI7500Real-Time PCR Systems)或CFX9600实时系统（CFX9600Real-Time System)实时确认了RT-PCR扩 增产物。
[0077] 实施例1:利用双链引物(Double-stranded primer;DSP)系统的实时聚合酉每链反 应的扩增曲线确认试验
[0078] 该试验是通过利用形成双链的引物/探针的实时聚合酶链反应来确认PCR扩增曲 线的试验。前方引物的5'-末端中，从第4个序列起，是与探针杂交结合的双链引物/探针。前 方引物的5 ' -末端结合有作为猝灭颜料的TAMRA，探针的3-末端结合有作为报道颜料的FAM。 [0079] *DSP试验用引物和探针
[0080]前方引物：5，-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3，
[0081 ]探针：5，-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0082] 后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0083] *RT_PCR 反应条件：
[0084] 95。(：、5分（1次），
[0085] 95Γ、15秒-60、40秒-72Γ、30秒（反复35次）
[0086] *RT_PCR反应物组成
[0087] 将预先混合好ADNA lul (100pg)、上述2种引物和探针各lul (10pmol/ul)及Taq DNA聚合酶等实时PCR中所需的反应组合物的3. IX qPCRMix 6.45ul与灭菌水混合，最终制 备成20ul的总容量以备使用。
[0088]观察到随着PCR扩增产物生成，DSP探针被水解，FAM的信号逐渐增加的典型RT-PCR 信号。由此可确认形成双链的引物/探针不妨碍RT-PCR链反应(图2)。
[0089] 实施例2:基于DSP探针的5 末端结构的特性的实时聚合酶链反应 [0090]通过改变DSP探针的5-末端结构来确认5'核酸酶活性化程度差。探针的5-末端结 构使用如下探针进行试验：没有激发结构的探针(Mis+0);1个碱基具有激发结构的探针 (Mis+Ι);具有2个激发结构的探针(Mis+2);具有3个激发结构的探针(Mis+3)。
[0091] *引物
[0092] 前方引物：5，-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3，
[0093] 后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0094] * 探针
[0095] Mis+0:5，-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0096] Mis+1:5，-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0097] Mis+2:5，-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0098] Mis+3:5，-catccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0099] *RT_PCR 反应条件
[0100] 95。(：、5分（1次）
[0101] 95°C、15秒-60°C、30秒-72°C、30秒(反复40次）
[0102] *RT-PCR反应物组成
[0103] 将预先混合好ADNA lul (100pg)、上述2种引物和探针各lul (10pmol/ul)及Taq DNA聚合酶等实时PCR中所需的反应组合物的3. IX qPCRMix 6.45ul与灭菌水混合，最终制 备成20ul的总容量以备使用。
[0104]如图3所示，根据探针的5-末端的激发结构可确认出现Taq DNA聚合酶的5'核酸酶 活性差。使用Mis+Ο和Mis+Ι探针的试验中，PCR扩增曲线呈现增加趋势，但使用具有1个激发 结构的Mis+Ι探针的情况的扩增曲线的Ct值更大。使用Mis+2和Mis+3探针的试验中，信号未 被扩增。这些结果反映了与以往TaqMan探针不同地DSP探针位于PCR扩增产物末端的现象和 探针的5-末端激发结构差。并且，通过这些结果可类推基于Taq DNA聚合酶的5'-3'外切核 酸酶作用的游离FAM生成被5-末端的激发结构抑制。
[0105] 实施例3:具有基于多种探针形态的5-末端激发结构的探针的实时聚合酶链反应
[0106] 为了更具体地确认基于实施例2中产生的5'-末端结构的Taq DNA聚合酶的瓣状内 切核酸酶(FEN)活性抑制作用，利用DSP探针和SYBR Green探针及外侧(External)TaqMan探 针和TaqMan探针，确认PCR扩增产物的探针结合位点和基于探针的5末端结构的Taq DNA 聚合酶的5核酸酶活性差。
[0107] 实施例的引物和探针RT-PCR条件如下。
[0108] *DSP探针试验用引物（图4a)
[0109]前方引物：5，-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3 '
[0110]后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0111] *探针
[0112] Mis+0：5'-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
[0113] Mis+1：5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
[0114] Mis+2：5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
[0115] *SYBR Green探针试验用引物（图4b)
[0116]前方引物：5，-gccgcgctggatgaactgatac-3 '
[0117]后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0118] * 探针
[0119] Mis+0:5 '-ccggtatcagttcatccagcgc-3 '
[0120] Mis+1:5 '-tccggtatcagttcatccagcgc-3 '
[0121] Mis+2:5 '-atccggtatcagttcatccagcgc-3 '
[0122] *外侧TaqMan探针试验用引物和探针（图5a)
[0123] 前方引物：5 ' -taccggggttgctgagtgaatata-3 '
[0124] 后方引物：5 ' -cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0125] 探针
[0126] Mis+0:5 '-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0127] Mis+1:5 '-FAM-acgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0128] Mis+2:5 '-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0129] *TaqMan探针试验用引物和探针(图5b)
[0130] 前方引物:5' -gccgcgctggatgaactgatac-3'
[0131 ]后方引物：5 ' -cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0132] 探针
[0133] Mis+0:5 '-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0134] Mis+1:5，-FAM-acgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0135] Mis+2:5，-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0136] *实时聚合酶链反应条件
[0137] 95°(：、5分（1次）
[0138] 95 °C、15秒-60、30秒-72 °C、30秒（反复35次）
[0139] *PCR反应物组成
[0140] 将ADNA lul( 100pg)、2种引物和探针各lul (10pmol/ul)、SYBR Green(Takara) lul (10X)及3.1X qPCRMix 6.45ul与灭菌水混合，最终制备成20ul的总容量以备使用。
[0141] 如图4、图5所示，根据探针的形态，PCR扩增曲线也呈现不同形态。就前方引物和探 针杂交结合的SYBR Green、外侧TaqMan探针而言，与DSP类似地根据探针末端的激发结构呈 现PCR扩增曲线的差异。即，没有激发结构的Mis+0和激发结构为1个的Mis+1探针被水解，激 发结构为2个的Mi s+2不出现PCR扩增曲线的增加（图4a、图4b、图5a)。但是，就TaqMan探针系 统而言，与探针的种类无关地，信号被扩增（图5b)。由这些结果可确认若探针位于PCR扩增 产物末端，则根据5 末端结构的差异，会发生基于Taq DNA聚合酶的5 '核酸酶活性的信号 的扩增的差异。但是，探针位于PCR扩增产物的中间的TaqMan探针与5'-末端结构无关地均 被水解。
[0142] 实施例4:从影响5'-外切核酸酶活性化程度的PCR扩增产物的末端到探针的杂交 结合位点为止的距离确认试验
[0143] 该试验是当5-末端具有激发结构的探针位于PCR扩增产物的末端时，确认末端的 距离是否对Taq DNA聚合酶的5-核酸酶活性带来影响的试验。NSTS/sybr-green探针及 NSTS/taqman探针使用于试验。固定各个后方引物和探针，并将前方引物沿着PCR扩增产物 的3'-末端方向移动来做试验。以从前方引物5-末端到杂交结合的探针的5-末端激发结构 为止的距离作为基准，NSTS/sybr-green探针使用了相当于23碱基、26碱基、28碱基、30碱基 的前方引物（图6)，NSTS/taqman探针为27碱基、32碱基、34碱基、38碱基（图7)。·s+2探针在 Mi s+0的5 末端追加任意2碱基来进行合成。
[0144] *SYBR Green试验用引物和探针
[0145] 后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0146] 探针
[0147] Mis+0:5 '-ggtatcagttcatccagcgc-3 '
[0148] Mis+2:5，-atggtatcagttcatccagcgc-3，
[0149] ① 23 碱基前方引物：5 ' -gccgcgctggatgaactgatac-3 '
[0150] ② 26 碱基前方引物：5 ' -gcagccgcgctggatgaactga-3 '
[0151 ]③ 28 碱基前方引物：5 ' -aagcagccgcgctggatgaact-3 '
[0152] ④ 30 碱基前方引物：5 ' -caaagcagccgcgctggatgaa-3 '
[0153] *外侧TaqMan探针试验用引物和探针
[0154] 后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0155] 探针
[0156] Mis+0:5，-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0157] Mis+2:5 '-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3 '
[0158] ① 27 碱基前方引物：5 ' -taccggggttgctgagtgaatata-3 '
[0159]② 32 碱基前方引物：5 ' -actgataccggggttgctgagt-3 '
[0160]③ 34 碱基前方引物：5 ' -gaactgataccggggttgctga-3 '
[0161 ]④ 38 碱基前方引物：5 ' -ggatgaactgataccggggttg-3 '
[0162] *实时聚合酶链反应条件
[0163] 95°(：、5分（1次）
[0164] 95°C、15秒-60°C、30秒-72°C、30秒(反复35次）
[0165] *PCR反应物组成
[0166] 将ADNA lul(100pg)、2种引物和探针各lul(10pmol/ul)、SYBR Green(10X)lul及 3.1X qPCRMix 6.45ul与灭菌水进行混合，最终制备成20ul的总容量，以备使用。
[0167]在NSTS/sybr-green探针中，从前方引物5-末端到杂交结合的探针的5-末端为止 的距离为30碱基，在NSTS/taqman探针中，从34碱基起，Mis+2探针的PCR扩增曲线被增加（图 6、图7)。由此可确认从前方引物5-末端到杂交结合的探针的5-末端为止的距离在NSTS探针 的5瓣状结构识别中起到重要因素的作用。这将被类推为是因为聚合酶的5'核酸酶活性中 识别5 '瓣状来切割的FEN活性从5 '瓣状的末端起需要规定长度(约28-34碱基）以上，其以下 的情况下，FEN不能顺利起作用。并且，用于区分利用NSTS的SNP等的突变部位的诊断用引 物/探针的设计时，只要适当地维持从两个5-末端到杂交结合的探针的5'-末端为止的距离 (约28-30碱基以内），才能知道是否能够实现所目的的区分。
[0168] 实施例5:用于SNP分型的探针对测试
[0169] 利用针对NSTS探针的聚合酶的FEN活性差，改变探针的5'-末端结构，以便适用于 SNP分型。以预测变异的碱基（SNP点）中心，假设SNP存在，制造 NSTS/dsp探针的对来进行试 验。
[0170] ①探针的5'-末端结构使用了没有激发结构的探针(Mis+Ο)、1个碱基具有激发结 构的探针(Mis+Ι)、②1个碱基具有激发结构的探针(Mis+Ι)和具有2个激发结构的探针(Mis +2)、③5-末端的第二个碱基1个具有激发结构的探针(Mis+2(1))和具有2个激发结构的探 针(Mis+2)、④5-末端的第三个碱基1个具有激发结构的探针(Mis+3(2))和5-末端的第二个 和第三个碱基具有激发结构的探针(Mis+3( 1))(图8)。
[0171] *试验用引物和探针
[0172] 前方引物：5，-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3 '
[0173] 后方引物：5，-cggcctgaacagtgagcgaag-3 '
[0174] ①探针组
[0175] aMis+0:5，-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0176] bMis+1:5 '-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0177] ②探针组
[0178] aMis+1：5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
[0179] bMis+2:5 '-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3 '
[0180] ③探针组
[0181] aMis+2(l):5'-ctccggtatcagttcatccagcgc-FAM_3'
[0182] bMis+2：5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
[0183] ④探针组
[0184] aMis+3(2):5，-actccggtatcagttcatccagcgc-FAM_3'
[0185] bMis+3(l):5，-agaccggtatcagttcatccagcgc-FAM_3'
[0186] *实时聚合酶链反应条件
[0187] 95°(：、5分（1次）
[0188] 95°C、15秒-60°C、30秒-72°C、30秒(反复40次）
[0189] *PCR反应物组成
[0190] 将λ?ΝΑ lul(100pg)、2种引物和探针各lul(10pmol/ul)及3.1x qPCRMix 6.45ul 与灭菌水混合，最终制备成20ul的总容量以备使用。
[0191] 利用根据探针的5-末端的激发结构而呈现的Taq DNA聚合酶的5'FEN活性差，预测 SNP分型时会出现的结构差异，可构成为上述4个探针对构成。由利用其的试验结果可确认 到各组的b探针比起a探针Ct值更小或者PCR扩增曲线未被增加。尤其是，如②、③、④的探针 组根据探针来将PCR扩增区分为开/关，并适用于SNP分型，由此呈现可明确利用于解读相关 等位基因的优点。
[0192] 实施例6:利用NSTS/sybr-green的多种探针对的SNP分型适用检测
[0193] 改变NSTS/sybr-green探针的5'-末端结构，在SNP分型中使用SYBR Green来确认 实质性适用可能性与否。将ADNA作为模板，指定任意的SNP点，并指定基于5末端结构变化 的DSP探针对。使用的DSP探针对为Mi s+1 和Mi s+2 (图 9a)、Mi s+3 (2)和Mi s+3 (1)(图 9b)、Mi s+ 2(1)和Mis+2(图9c)。
[0194] *试验用引物和探针（图9a)
[0195] 前方引物：5，-cgctgtggctgatttcgataacc-3 '
[0196] 后方引物：5 ' -tggctgacgttcccatgtacc-3 '
[0197] 探针对
[0198] Mis+1:5 '-taggttatcgaaatcagccac-3 '
[0199] Mis+2:5，-tcggttatcgaaatcagccac-3，
[0200] *试验用引物和探针（图9b)
[0201 ]前方引物：5 ' -tctcggaatgcatcgctcagtg-3 '
[0202] 后方引物：5，-atgctcaatggatacatagacgagg-3 '
[0203] 探针对
[0204] Mis+3(2):5，-agctcaacactgagcgatgcattc_3'
[0205] Mis+3(1):5，-aactcaacactgagcgatgcattc_3'
[0206] *试验用引物和探针（图9c)
[0207] 前方引物：5，-ctgctgggtgtttatgcctactt-3 '
[0208] 后方引物：5，-aagttctcggcatcaccatccg-3 '
[0209] 探针对
[0210] Mis+2(1):5，-cgataaagtaggcataaacaccca_3'
[0211 ] Mis+2：5'-tgataaagtaggcataaacaccca-3'
[0212] *实时聚合酶链反应条件
[0213] 95°(：、5分（1次）
[0214] 95°C、15秒-65°C、30秒-72°C、30秒(反复40次）
[0215] *PCR反应物组成
[0216] 将DNA lul(100pg)、2种引物和探针各lul(5pmol/ul)、SYBR Green(10X)lul及 3.1x qPCRMix 6.45ul与灭菌水混合，最终制备成20ul的总容量，以备使用。
[0217]利用SYBR Green的PCR扩增曲线，根据任意指定的SNP点与探针的5'-末端一致或 不一致而产生的激发结构，确认了其被区分为PCR扩增曲线的增加或未增加。在SNP点不一 致的情况下，PCR扩增曲线完全未增加，从而可明确区分SNP分型。由此可知，若利用本发明 的方法，则不使用昂贵的颜料探针，而使用经济实惠的与SYBR Green等的DNA双键相结合的 插入剂（intercalating agents)或表面粘合剂（surface binding agents)，由此可适用简 便的SNP分型。
[0218] 实施例7:实时聚合酶链反应时不受退火温度差影响的NSTS探针作用的稳定性确 认试验
[0219] 上述试验是确认根据酶作用的反应特异性来区分的NSTS探针在实时聚合酶链反 应中到底受退火温度的何种影响的试验。利用NSTS/sybr-green探针，使剩余PCR条件相同， 只改变退火温度，探针使用了 5-末端的第3个碱基1个具有激发结构的探针(Mis+3(2))和5-末端的第一个和第三个碱基具有激发结构的探针(Mis+3(1))。
[0220] *DSP探针试验用引物和探针
[0221 ]前方引物 la: 5-TGATGGAGCAGATGAAGATGCTCG-3 [0222]后方引物 las: 5-TCCAGCTCACTCTCAATGGTGG-3 [0223] 探针对
[0224] Mi s+3(2)/1：5-GTCTCGAGCATCTTCATCTGCTC-3
[0225] Mis+3(1)/1:5-TTCTCGAGCATCTTCATCTGCTC-3
[0226] 前方引物 2a: 5-CGCTGTGGCTGAITTCGATAACC-3
[0227] 后方引物 2as: 5-TGGCTGACGTTCCCATGTACC-3 [0228] 探针对
[0229] Mis+3(2)/2:5-GATCAGGTTATCGAAATCAGCCAC-3
[0230] Mis+3(1)/2:5-AATCAGGTTATCGAAATCAGCCAC-3
[0231] 前方引物 3a:5-GTTCCTGACCGTGTGGCTTAC-3
[0232] 后方引物 3as: 5-ATCCCCATACGCGCATTTCGTAG-3
[0233] 探针对
[0234] Mis+3(2)/3:5-GGACAGGTAAGCCACACGGTCAG-3
[0235] Mis+3(1)/3:5-TGACAGGTAAGCCACACGGTCAG-3
[0236] 前方引物 4a: 5-CTGCTGGGTGTTTATGCCTACTT-3
[0237] 后方引物 4as: 5-AAGTTCTCGGCATCACCATCCG-3
[0238] 探针对
[0239] Mi s+3(2)/4:5-TCGATAAAGTAGGCATAAACACCCA-3
[0240] Mis+3(1)/4:5-GCGATAAAGTAGGCATAAACACCC-3
[0241] 前方引物 5a: 5-CCACACGGCATTCGGCAGATAT-3
[0242] 后方引物 5as: 5-AGCGCCTGTTTCTTAATCACCATA-3
[0243] 探针对
[0244] Mis+3(2)/5:5-GGTGGAATATCTGCCGAATGCCGTG-3
[0245] Mis+3(1)/5:5-CGTGGAATATCTGCCGAATGCCGT-3
[0246] *实时聚合酶链反应条件1
[0247] 95。(：、5分（1次）
[0248] 95Γ、15秒-65Γ、30秒-72Γ、30秒（反复40次）
[0249] *实时聚合酶链反应条件2
[0250] 95。(：、5分（1次）
[0251 ] 95°C、15秒-54°C、30秒-72°C、30秒(反复40次）
[0252] *PCR反应物组成
[0253] 将ADNA lul(100pg)、2种引物和探针各lul(5pmol/ul)及5x qPCRMix(50mM Tris、 pH 9.0,7.5mM MgCl2、300mM KC1、1M甲基葡萄糖、500mM(NH4)2S〇4、5mM dNTPs、5u Taq DNA 聚合酶，（株)吉诺思，韩国）4u 1与灭菌水混合，最终达到总容量20u 1来使用。
[0254] 将退火温度改变为10°C以上进行PCR，如图10所示，确认到Ct值上无明显差异，靶_ 特异性探针的PCR扩增曲线与温度变化无关地明确区分。根据基于酶的反应特异性可确认 到呈现区分性的NSTS的等位基因特异性探针的作用不受PCR温度，这些结果表示本发明的 方法有效地同时分析多种SNP。
[0255] 产业上的可利用性
[0256] 根据本发明，提供快速而且灵敏度和特异度优秀的适用新原理的经济性基因突变 检测单元，因此本发明的方法可广泛利用于农、水、畜产品等的基因突变检测或医学领域的 诊断等。
[0257] 序列表自由正文
[0258] 序列表的序列是为了说明对于突变基因检测方法的本发明的结构而任意制作的 引物和探针等。
[0259] 本申请根据中小企业厅支援的2014年度中小企业技术革新开发事业课题"有效而 经济的基因突变检测用分子诊断平台开发及产品化"（课题编号S2166257)执行。
【主权项】
1. 一种抑制或去除DNA聚合酶中的5 瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反应 来检测突变基因的方法，其特征在于，包含5 瓣状内切核酸酶活性。2. 根据权利要求1所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，上述DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。3. 根据权利要求1所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，通过执行选自如下方法中的一种以上方法来抑制 或去除5 瓣状内切核酸酶活性： 方法a)，调节酶反应条件， 方法b )，利用5 瓣状内切核酸酶活性被抑制或去除的重组DNA聚合酶， 方法c)，添加5 瓣状内切核酸酶活性抑制剂，以及 方法d)，在DNA聚合酶上调节引物及探针中的一种以上的结合位点。4. 根据权利要求3所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，上述方法d)中，通过使扩增用前方引物5'-末端和 探针的5 末端位于DNA聚合酶24-38碱基以内，来抑制活性。5. 根据权利要求3所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，探针为在5 末端具有瓣状部位的探针。6. 根据权利要求3所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，探针的5'-末端具有1碱基以上的连续激发结构或 非连续激发结构。7. 根据权利要求1所述的抑制或去除5'-瓣状内切核酸酶活性，并通过实时聚合酶链反 应来检测突变基因的方法，其特征在于，检测对象突变基因表示单核苷酸多态性、1碱基以 上的缺失、置换及插入中的一种以上。8. -种利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来检测突变基因的方 法，其特征在于，通过利用包含5'-瓣状内切核酸酶活性的DNA聚合酶的实时聚合酶链反应 来检测突变基因。9. 根据权利要求8所述的利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来检 测突变基因的方法，其特征在于，上述探针中的基因突变部位位于探针的5'-末端。10. 根据权利要求8所述的利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来 检测突变基因的方法，其特征在于，突变基因表示单核苷酸多态性、1碱基以上的缺失、置换 及插入中的一种以上。11. 根据权利要求8所述的利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来 检测突变基因的方法，其特征在于，上述探针根据等位基因，诱导DNA聚合酶的5'-瓣状内切 核酸酶活性被抑制的5 末端瓣状结构。12. 根据权利要求11所述的利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来 检测突变基因的方法，其特征在于，用于诱导DNA聚合酶的5'-瓣状内切核酸酶活性被抑制 的5'-末端瓣状结构的探针为具有一个5'-瓣状碱基的结构、具有两个5'-瓣状碱基的结构 或非连续激发结构，且为具有两个5 瓣状碱基，一个末端碱基为匹配的结构Mis+3( 1)。13. 根据权利要求10所述的利用抑制DNA聚合酶中的5'-瓣状内切核酸酶活性的探针来 检测突变基因的方法，其特征在于，1碱基以上的缺失、置换及插入中的一种以上的突变部 位位于DNA聚合酶的FEN活性被抑制的探针的5 末端。14. 一种基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其为基因突变检测用聚合酶链反 应试剂盒，其特征在于，包含试样DNA、双链前方引物、双链后方引物、探针及耐热性DNA聚合 酶，上述探针抑制DNA聚合酶的FEN活性。15. 根据权利要求14所述的基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，上 述探针为报道颜料和猝灭颜料同时被修饰的双标记探针或非修饰探针。16. 根据权利要求14所述的基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，上 述双链前方引物及双链后方引物分别包含互补结合序列，探针为报道颜料和猝灭颜料同时 被修饰的双标记探针。17. 根据权利要求15所述的基因突变检测用实时聚合酶链反应试剂盒，其特征在于，使 用上述非修饰探针的情况下，追加与DNA双键相结合的插入剂或表面粘合剂。
【文档编号】C12Q1/68GK106068329SQ201580003899
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年1月8日 公开号201580003899.5, CN 106068329 A, CN 106068329A, CN 201580003899, CN-A-106068329, CN106068329 A, CN106068329A, CN201580003899, CN201580003899.5, PCT/2015/167, PCT/KR/15/000167, PCT/KR/15/00167, PCT/KR/2015/000167, PCT/KR/2015/00167, PCT/KR15/000167, PCT/KR15/00167, PCT/KR15000167, PCT/KR1500167, PCT/KR2015/000167, PCT/KR2015/00167, PCT/KR2015000167, PCT/KR201500167
【发明人】金载钟, 车善浩, 林时圭
【申请人】基诺泰科有限公司