一种以氨基酸水解液及水稻秸秆为原料生产木霉固体菌种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以氨基酸水解液及水稻秸秆为原料生产木霉固体菌种的方法。本发明利用具有良好植物根际促生作用的丝状真菌Trichoderma harzianum，在28℃培养条件下充分利用富含木质纤维素的水稻秸秆和废弃畜禽氨基酸水解液养分快速生长并产孢，固体发酵5?6天后贵州木霉NJAU4742的厚垣孢子数量高达到2.4×1010spore/g，将该固体菌种直接添加到腐熟有机肥中，可快速生产稳定且有效活菌数>2×108的木霉氨基酸生物有机肥，该生物有机肥对番茄具有很好根际促生作用。CGMCC No.1216620160411
【专利说明】
一种以氨基酸水解液及水稻秸秆为原料生产木霉固体菌种的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物肥料领域，涉及一种以氨基酸水解液及水稻秸杆为原料生产木霉 固体菌种的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻秸杆是一种重要的农业资源，可用于畜禽饲料、造纸原料、建筑材料、生物质 能源及有机肥原材料等。我国水稻种植面积达3000万hm 2,水稻秸杆资源丰富。由于利用率 不高，特别是大部分农村的稻草仍被丢弃或焚烧等的利用不合理导致浪费了资源造成了严 重的环境污染，不利于环境保护，更不利于生态的可持续发展，近几十年来，证实了稻秸杆 经微生物降解后在土壤肥料方面具有绝对的优势和潜力。水稻秸杆作为一种重要的生物质 资源，将越来越多地被用作有机肥的主要原料。水稻秸杆富含纤维素，还含有钾、钙、磷等多 种化学元素，是土壤中有机质的主要来源，通过在田间自然腐烂，不但可以肥田、改善土壤 土质，还可以增加下茬作物的产量。
[0003] 另一方面，高度集约化的养殖业中动物正常死亡率提高，而遇到突发性疫病死亡 率就更高。如果这些废弃畜禽不进行有效的无害化处理，直接丢弃将造成严重的环境污染， 被不法分子获得并进入市场则对人们的身体健康及公共安全造成严重威胁。废弃畜禽也是 引发动物疫病的重要传染源，目前国内对病死畜禽的处理方法主要有:直接深埋，建沼气池 将其发酵，直接焚烧等方法。这些方法都有其弊端，如造成环境污染或水质污染，而将废弃 畜禽酸水解生产农用氨基酸，其不仅无害化解决了上述问题，同时为新型生物有机肥的研 制提供丰富的原料。微生物有机肥不仅具有较好的肥效，添加的氨基酸水解液更能为功能 微生物提供丰富的养分，使其在土壤中更易于根际定殖并刺激植物生长及诱导植物产生系 统抗性。
[0004] 木霉(Trichoderma sp.)是一类重要的生防真菌，按传统分类系统，属于半知菌亚 门（Deuteromycotina)、丝抱纲（Hyphomycetes)、丝抱目（Hyphomycetales)、丝抱科 (Hyphomycetaceae)。近年来人们发现，生防木霉不仅对植物病原真菌具有诘抗效应并能促 进植物的生长，同时木霉有很强的根际定植能力，其代谢产物有抗生素、生长素等分泌物具 有溶磷、固氮等作用促进植物生长。已有大量报道指出，贵州木霉对辣椒、马铃薯、莴苣、黄 瓜、白菜、豌豆、花生、长春花和菊花等多种作物有促生效应。在土壤中加入贵州木霉可以有 效地促进植物的生长，提高作物的产量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决水稻秸杆和养殖场废弃畜禽及屠宰下脚料资源不合理 利用导致的环境污染问题，提供一种以水稻秸杆和废弃畜禽氨基酸水解液为原料生产木霉 固体菌种的方法，所得木霉固体菌种可直接添加到腐熟有机肥中生产高附加值的木霉生物 有机肥。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] -种以氨基酸水解液及水稻秸杆为原料生产木霉固体菌种的方法，将水稻秸杆粉 碎加入稀释后的废弃畜禽氨基酸水解液中浸泡过夜，然后用Κ0Η调节浸泡秸杆的pH值至 3.5-4.5，将调好pH的水稻秸杆捞出，调节含水量至70%-75% (w/w)，搅拌至蓬松状，向其中 添加玉米粉搅拌均匀后作为基质，向基质中接种贵州木霉发酵菌液，搅拌均匀后平铺在浅 盘内，并置于暗室中发酵。
[0008] 本发明所述方法中，水稻秸杆在浸泡前优选粉碎为〇. 5-1.5cm的细粉末状。
[0009] 本发明所述方法中，废弃畜禽氨基酸水解液优选通过以下方法制备得到：（1)在密 闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后， 在初始酸浓度c(l/2H 2S〇4)为3-5mol L-^δΟ-ΙΟΟΓ和1-2个大气压下水解2-5小时；
[0010] (2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80°C以下时，利用能出入水解罐加料口漂浮 直立在油脂上的真空倒吸装置分离上层油脂；
[0011] (3)油脂被分离后，在水解罐中按水解液与氢氧化钾质量比为4:1慢慢加入氢氧化 钾，边加边搅拌，调整溶液pH值为1-3;或按水解液与龙虾壳或螃蟹壳质量比为10:3在水解 液中加入龙虾壳或螃蟹壳，升温至温度80°C、1_2个大气压内下维持1-2小时，然后待温度降 至30°C以下，按水解液与氢氧化钾质量比为12.5:1慢慢加入氢氧化钾，调整溶液pH值为1-3；
[0012] (4)将调整pH值后的水解液从水解罐中放入由聚四氟乙烯塑料制成的容器内，让 其自然沉淀1-1.5小时，收集氨基酸溶液;必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉 淀2-3小时，收集氨基酸溶液。
[0013] 本发明所述方法中，优选将水稻秸杆加入30~40体积倍稀释后的废弃畜禽氨基酸 水解液中浸泡过夜;进一步优选将水稻秸杆加入30体积倍稀释后的废弃畜禽氨基酸水解液 中浸泡过夜；以起到软化秸杆并在低pH条件下对秸杆进行灭菌的作用。
[0014] 本发明所述方法中，优选用Κ0Η调节浸泡秸杆的pH值至3.5。
[0015]本发明所述方法中，所述的玉米粉添加量优选为10wt%~40wt%(以秸杆干重为 基准），进一步优选30wt%。
[0016] 本发明所述方法中，贵州木霉孢子通过贵州木霉发酵液的形式添加，发酵液添加 量为20%~50%(g/100ml)，优选20%;所述的贵州木霉发酵液中木霉数量约为10 8spore/ mL〇
[0017] 本发明所述方法中，浅盘中秸杆厚度为2cm-5cm，保鲜膜封口戳开少许孔(氧气）； 暗室中发酵的温度为28°C-32°C，发酵的时间为7-10天。
[0018] 一种木霉菌剂生物有机肥制备方法，包括按照本发明上述方法制备木霉固体菌种 (有效活菌数lxl〇1()Sp〇re/g dw)，按1%的量直接与发酵好的氨基酸有机肥进行复配，搅拌 混匀后获得贵州木霉氨基酸生物有机肥，其中有效活菌数高达到4.8X108sp〇re/g。
[0019] 本发明所述的木霉菌剂生物有机肥制备方法还可包括对贵州木霉氨基酸生物有 机肥的分筛和/或造粒。
[0020] 本发明所述的贵州木霉适用于所有的贵州木霉，尤其适用于具有促生作用，用于 生产生物肥料的贵州木霉，如自行分离及市售的木霉生防菌株均适用于本发明方法;优选 保藏号为06]\1〇^?^0.12166的贵州木霉?^\1]4742(1'1'；!_(311〇(161'11^8111211〇1161186)
[0021] 有益效果：
[0022] 本发明是一种能将水稻秸杆添加废弃畜禽氨基酸水解液通过接种根际促生菌贵 州木霉菌种，快速生产木霉固体菌种及木霉氨基酸生物有机肥，本发明的有益效果在于：
[0023] (1)本发明针对工厂化木霉固体发酵存在的上述瓶颈问题，一改传统的固体材料 灭菌之思路，通过调控固体材料的pH值，创造一个让木霉快速生长、繁殖和抑制其他杂菌生 长的固体发酵材料的酸度，同时，筛选出最佳的木霉营养配方，创造性地建立了一种廉价的 木霉固体菌种发酵专利技术工艺，本发明克服了木霉菌株长期以来固体发酵产孢量低的问 题，为生产木霉氨基酸生物有机肥提供坚实的基础;按1 %的量直接与发酵好的氨基酸有机 肥进行复配，搅拌混匀后获得贵州木霉氨基酸生物有机肥，其中有效活菌数高达到4.8 X 108sp〇re/g，达到生物有机肥的行业标准。
[0024] (2)本发明所制备的生物有机肥的有效活菌数比菌丝更能长期稳定存放，所得生 物有机肥品质优良。
[0025] (3)实现了养殖场大量废弃物的资源化利用实现了构建生态农业的可持续发展战 略。将废弃猪肉酸解生产农用氨基酸，其不仅给废弃猪肉的合理无害化处理提供了新思路， 为木霉有益菌株的产孢提供了良好的养分条件，还有利于新型生物有机肥的研制。
[0026] (4)本发明拓宽了木霉固体发酵产孢培养基主料水稻秸杆的有效循环利用，既有 利于自然生态保护，减少环境污染，又可变废为宝，降低木霉发酵生产成本，产生良好的经 济效益，最大可能地实现经济社会效益，同时也符合当今循环可持续发展的战略方针。
【附图说明】
[0027] 图1贵州木霉NJAU4742的厚垣孢子悬浮液
[0028]图2贵州木霉4742的厚垣孢子血球计数板计数
[0029]图3不同稀释倍数氨基酸水解液浸泡对贵州木霉NJAU4742产孢子的影响
[0030]图4贵州木霉NJAU4742不同初始pH值得固体发酵结果
[0031] 图5贵州木霉NJAU4742不同初始pH的产孢曲线
[0032]图6不同初始pH对贵州木霉NJAU4742产孢的影响
[0033]图7不同玉米粉添加量对贵州木霉NJAU4742产孢的影响
[0034]图8贵州木霉NJAU4742氨基酸生物有机肥产品
[0035]图9贵州木霉NJAU4742氨基酸生物有机肥盆栽促生效果
[0036]生物材料保藏信息
[0037] NJAU4742,分类命名贵州木霉(Trichoderma guizhouense)，保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，保藏日期为2016年4月11日，菌株保藏号CGMCC No.12166。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例以贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)为例举例说明本发 明的技术方案，但并不因此限定本发明的保护范围。实际上，发明人按照本发明方法，以多 种自行分离及市售的木霉生防菌株进行固体发酵，均获得了与实施例1相似的效果，但鉴于 专利公开充分的要求，以下仅以贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)为例，说明 本发明的木霉固体菌种发酵方法。
[0039] 实施例1
[0040] 1、菌株的观察
[0041 ]菌株为贵州木霉1^\114742(1'1'；[0110(161'1]^8111211〇1161186)，具有以下特征:贵州木霉 分离至中药渣堆肥，进化上属于哈茨木霉分支;其菌丝能够强重寄生灰葡萄孢菌、交链格孢 菌、核盘菌、立枯丝核菌、齐整小核菌和尖孢镰刀菌;贵州木霉有独特的光照敏感性，提高孢 子浓度;原位荧光研究表明贵州木霉能定殖土壤和植物根际，促进植物生长，抑制植物病害 发生，提高农作物的产量。
[0042] 2、菌株的培养
[0043] 1)将菌株NJAU4742接种到固体培养基TOA玻璃培养皿中，培养条件为：28°C、7天， 将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌水洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的玻璃瓶中制 备成了孢子悬液备用，如图1所示。
[0044] 2)将贵州木霉NJAU4742孢子液按照1 %接种到配置好的PDA培养基中摇瓶培养，装 液量为三角玻璃瓶体积的20 % -50 %，培养条件为:温度为28°C、180rmp、4天，培养结束后， 利用血球计数板检测发酵的结果，如图2所示。
[0045] 实施例2
[0046] 1、废弃畜禽氨基酸水解液的制备方法
[0047] (1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入 密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(l/2H 2S〇4)为3-5mol Ι^ΑΟ-ΙΟΟΓ和1-2个大气压下水解 2-5小时；
[0048] (2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80°C以下时，利用能出入水解罐加料口漂浮 直立在油脂上的真空倒吸装置分离上层油脂；
[0049] (3)油脂被分离后，在水解罐中按水解液与氢氧化钾质量比为4:1慢慢加入氢氧化 钾，边加边搅拌，调整溶液pH值为1-3;或按水解液与龙虾壳或螃蟹壳质量比为10:3在水解 液中加入龙虾壳或螃蟹壳，升温至温度80°C、1_2个大气压内下维持1-2小时，然后待温度降 至30°C以下，按水解液与氢氧化钾质量比为12.5:1慢慢加入氢氧化钾，调整溶液pH值为1-3；
[0050] (4)将调整pH值后的水解液从水解罐中放入由聚四氟乙烯塑料制成的容器内，让 其自然沉淀1-1.5小时，收集氨基酸溶液;必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉 淀2-3小时，收集氨基酸溶液。
[0051 ] 2、液体菌株的制备
[0052]所述的贵州木霉NJAU4742菌剂接种到PDA液体培养基中，进行液体发酵生产，装液 量为20%，接种量为106cfu/mL孢子，摇床温度28°C、170rpm、培养4天。
[0053] 所述的roA培养基为:去皮土豆，切成小块放入锅中煮沸20-30min，用2层纱布过滤 并定容到lOOOmL，加入20g葡萄糖，分装后115°C，30min，灭菌。
[0054] 3、贵州木霉NJAU4742固体发酵
[0055] 从农田收集水稻秸杆，风干后利用粉碎机将其粉碎成0.5-lcm长的片段待用。用自 来水将废弃畜禽氨基酸水解液稀释数倍后加入到粉碎的水稻秸杆中，充分拌匀后浸泡过 夜。过夜后用适当溶度K0H调节秸杆pH值，将调好pH的秸杆过滤并将含水量调至75%左右， 并按照一定比例添加玉米粉，搅拌均匀后即为固体发酵基质。按2% (孢子浓度108sp〇re/ mL，V/w)的接种量将液体菌种接种到固体基质中，采用浅盘发酵法28°C避光培养7-10天。发 酵结束时，发酵基质表面会由白色菌丝逐渐转为绿色，贵州木霉NJAU4742产生大量的孢子， 利用梯度稀释平板计数法，检测固体发酵过程中贵州木霉的产孢情况。
[0056] 3.1贵州木霉NJAU4742发酵产孢优化实验
[0057] 3.1.1不同稀释倍数废弃畜禽氨基酸水解液对贵州木霉NJAU4742产孢的影响
[0058]从图3中可知，稀释不同倍数的氨基酸水解液浸泡秸杆过夜后调节pH3.5后进行发 酵第7天，各处理产孢表现为30倍>40倍>50倍>60倍，方差分析结果也表明，秸杆发酵7天后 不同处理之间差异显著；
[0059] 3.1.2不同pH条件下产孢试验
[0060]从氨基酸水解液浸泡后调节至不同的初始PH，发酵结束后检测厚垣孢子数量，结 果如图5所示。pH3.5处理的孢子含量显著高于其他处理，通过测定各个处理每天的pH变化 表明秸杆发酵产孢是在第3天开始第3、4、5天大量产孢第6、7天产孢速度降低pH3.5处理在 发酵的第一天其pH就能达到5.5左右且在发酵过程中基本保持不变而NJAU4742最适生长pH 在5.5左右良好的环境条件，从而增强了其产孢能力。
[0061 ]图6是不同初始pH对木霉产孢的影响，结果表明，说明氨基酸水解液浸泡过夜后用 Κ0Η调节浸泡液至3.5后浸泡秸杆30min，无论是NJAU4742菌丝生长量还是产孢量量都明显 高于其他处理，PH4.0处理跟pH4.5处理的产孢量跟生物量低于pH3.5但高pH3.0和pH2.5。因 此，将pH设置为3.5~4.5，优选3.5。
[0062] 3.1.3不同添加量玉米粉对贵州木霉NJAU4742产孢的影响
[0063] 图7是将发酵好的水稻猜杆称5.0g添加到50mL无菌水中，28°C，180rpm，30min后用 4层无菌纱布过滤后的10倍稀释液，进行产孢计数，由结果可知，玉米粉30 %的添加量与对 照相比孢子颜色明显深。添加30%的玉米粉发酵秸杆处理对贵州木霉NJAU4742产孢有明显 的促进作用与对照相比差异显著，增加了孢子量且与对照相比增加达到5.26倍;处理10%、 20%、40%与对照相比，分别增加到对照的3.70、4.18、3.45倍，但通过涂布计数结果发现0( 产菌丝量显著高于添加玉米粉的处理。
[0064] 实施例3贵州木霉NJAU4742固体发酵
[0065]在大容量的中转箱中加入10L自来水后，再加入285mL的废弃畜禽氨基酸水解液充 分溶解后加入1.5Kg粉碎的水稻秸杆，搅拌均匀后常温浸泡过夜(可以软化秸杆并利用低pH 条件对秸杆进行灭菌），过夜后用固体Κ0Η和少许氨基酸原液调节秸杆pH至3.5,将调好pH的 原料捞出后，调节含水量为75%并搅拌至蓬松状，同时添加150g玉米粉，充分搅拌均匀即得 贵州木霉4742的发酵基质，按照20%(孢子浓度10 88口〇^/1111^，￥/\￥)的接种量进行接种贵州 木霉4742发酵液，并将固体基质平铺在浅盘内，秸杆厚度约2cm-5cm，置于28°C_32°C的暗室 中发酵第3-4天直至产孢，贵州木霉NJAU4742的厚垣孢子数量高达到2.4 X 101()spore/g。 [0066]实施例4贵州木霉NJAU4742氨基酸生物有机肥的生产 [0067] 1、氨基酸的添加
[0068] 取已经完全腐熟的普通有机肥(含水率在25%)，堆成条垛形状后，添加10-15%的 废弃畜禽氨基酸水解液，并用翻抛机不断的翻堆，将氨基酸水解液与腐熟有机肥充分的混 匀，不能有块状的固体存在。每天测定堆体的温度和pH的变化情况，并根据具体情况用翻抛 机进行翻堆，待温度和pH回升后立即停止堆肥(该过程一般持续6天）。
[0069] 2、功能菌的贵州木霉NJAU4742的添加
[0070]将发酵好的贵州木霉NJAU4742固体菌株(有效活菌数lxl01()Sp〇r e/g dw)，按1%的 量直接与准备好的氨基酸有机肥进行复配，搅拌混匀后获得贵州木霉NJAU4742氨基酸生物 有机肥，其中有效活菌数高达到4.8 X 108sp〇re/g，达到生物有机肥的行业标准。
[0071] 3、分筛与造粒
[0072] 充分拌匀的氨基酸生物有机肥，通过筛选机将比较粗的部分筛选出来，而细的部 分为氨基酸生物有机肥，该产品为黑色粉末状固体，并带有一定的酱香味，为优质的氨基酸 生物有机肥，产品如图8中粉末状肥料。
[0073] 为了适应不同地区对产品的需求，采用低温干燥技术对粉末状的氨基酸生物有机 肥进行造粒，产品如图8中颗粒状肥料。
[0074]实例5贵州木霉NJAU4742氨基酸生物有机肥的盆栽促生效果
[0075] 1、试验设计
[0076]表1番茄促生盆栽实验处理
[0077]
[0078] 2、实验结果
[0079]由图9可看出在红土中化肥CK处理番茄的株高跟茎粗都显著低于氨基酸有机肥处 理，且添加了 3%木霉的有机肥对番茄的促生又显著高于氨基酸有机肥。处理AA、AT3与对照 CK相比，株高分别比对照增加了 128.8%、163.9%，茎粗分别比CK增加了 115.6%、122.6%。 通过涂布计数结果发现AT3处理番茄根际土木霉活菌数达到2.3 X 107显著其他两个处理， 说明木霉根际定繁能力强且对番茄有显著的促生作用。
【主权项】
1. 一种以氨基酸水解液及水稻秸杆为原料生产木霉固体菌种的方法，其特征在于，包 括将水稻秸杆粉碎后加入稀释后的废弃畜禽氨基酸水解液中浸泡过夜，然后用KOH调节浸 泡秸杆的pH值至3.5-4.5，将调好pH的水稻秸杆捞出，调节含水量至70 %-75 %，搅拌至蓬松 状，向其中添加玉米粉搅拌均匀后作为基质，向基质中接种贵州木霉发酵液，搅拌均匀后平 铺在浅盘内，并置于暗室中发酵。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水稻秸杆在浸泡前粉碎为0.5-1.5cm的细 粉末状。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，废弃畜禽氨基酸水解液通过以下方法制备 得到： (1) 在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭 的水解罐后，在初始酸浓度c (1/2H2S04)为3-5mo 1 L-1、80-100 °C和1-2个大气压下水解2-5 小时； (2) 水解结束待水解罐内溶液冷却至80°C以下时，利用能出入水解罐加料口漂浮直立 在油脂上的真空倒吸装置分离上层油脂； (3) 油脂被分离后，在水解罐中按水解液与氢氧化钾质量比为4:1慢慢加入氢氧化钾， 边加边搅拌，调整溶液pH值为1-3;或按水解液与龙虾壳或螃蟹壳质量比为10:3在水解液中 加入龙虾壳或螃蟹壳，升温至温度80°C、1_2个大气压内下维持1-2小时，然后待温度降至30 °C以下，按水解液与氢氧化钾质量比为12.5:1慢慢加入氢氧化钾，调整溶液pH值为1-3; (4) 将调整pH值后的水解液从水解罐中放入由聚四氟乙烯塑料制成的容器内，让其自 然沉淀1-1.5小时，收集氨基酸溶液;必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉淀2-3小时，收集氨基酸溶液。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将水稻秸杆加入30~40倍稀释后的废弃畜 禽氨基酸水解液中浸泡过夜;优选将水稻秸杆加入30倍稀释后的废弃畜禽氨基酸水解液中 浸泡过夜。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用KOH调节浸泡秸杆的pH值至3.5。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玉米粉添加量为秸杆干重的10 %~ 40%，优选 30 %。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的贵州木霉发酵液的添加量为20%~ 50%，优选 20 %。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，浅盘中猜杆厚度为2cm-5cm;暗室中发酵的 温度为28°C_32°C，发酵的时间为7-10天。9. 一种木霉菌剂生物有机肥制备方法，其特征在于包括按照权利要求1~8中任一项所 述的方法制备木霉固体菌种，按1 %的量直接与发酵好的氨基酸有机肥进行复配，搅拌混匀 后获得贵州木霉氨基酸生物有机肥，其中有效活菌数高达到4.8X10 8sp〇re/g。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括对贵州木霉氨基酸生物有机肥的 分筛和/或造粒。
【文档编号】C12R1/885GK106085871SQ201610440785
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月18日
【发明人】沈其荣, 刘东阳, 李 荣, 刘秋梅, 王帅
【申请人】南京农业大学