一种用于保藏蜜环菌母种的培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明属于密环菌母种保藏技术领域，具体涉及一种用于保藏蜜环菌母种的培养基及其制备方法。该培养基由以下重量份数的原料制成：木屑55?65份；麸皮36?44份；玉米粉38?42份；磷酸二氢钾1.5?2.5份；硫酸镁0.5?1.5份；蛋白胨1.5?2.5份；维生素B1 0.01?0.02份；水800?1000份。其制备方法包括S1.配液、S2.分装和S3.灭菌三个步骤，制备方法中使用硅胶塞代替传统的棉塞，同时制备方法中对分装高度、灭菌温度、灭菌时间等均有明确要求。与现有技术相比，使用本发明提供的培养基进行蜜环菌母种的保藏可延长有效保藏时间至两年，同时蜜环菌母种的种性不易退化。
【专利说明】
一种用于保藏蜜环菌母种的培养基及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于密环菌母种保藏技术领域，具体涉及一种用于保藏蜜环菌母种的培养 基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 蜜环菌是人工种植天麻的伴生菌，人工培养与保藏蜜环菌菌种是种植天麻中重要 内容，关系到种植天麻的产量与质量，随着天麻市场日益扩大，人工保藏蜜环菌的菌种愈显 重要。保藏蜜环菌的菌种大多数人采用传统的斜面低温保藏法，优点是操作简单，使用方 便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等，缺点是容易变 异，因培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的特性改变，而影响 微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。菌种的保藏时间与培养基配方及制作方法有关， PDA配方制作的斜面菌种采用低温保藏法的保藏时间是3-4个月，低温保藏蜜环菌在加了琼 脂的培养基上，菌种易褐化及角质化，这是退化的标志，故此法保藏蜜环菌已被多数人所淘 汰。改良后的玉米粉l〇〇g、黄豆粉l〇g、麦麸80g、白糖20g、水1000ml作配方制作的菌种保藏 时间半年至一年，对防止菌种退化也有一定的作用。上述二法是蜜环菌菌种传统的保藏方 法，保藏时间短、且可能出现退化，故在天麻种植中要频繁的、定期的从事菌种保藏，费事费 力；如遇菌种退化，还会造成种植天麻的产量与质量下降。改良后的玉米粉l〇〇g、黄豆粉 l〇g、麦麸80g、白糖20g、水1000ml作配方制作的菌种能延长保藏时间能让我们看到了希望， 受到了启发，配方与制作方法的改进，就可能进一步提高菌种的保藏时间，这就是本次研究 的出发点。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于保藏蜜环菌种的培养基及其制备方 法，其可有效提高菌种的保藏时间且能保证菌种的种性不易退化。
[0004] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于保藏蜜环菌母种的培养基， 由以下重量份数的原料制成:木肩55-65份;麸皮36-44份;玉米粉38-42份;磷酸二氢钾1.5-2.5份;硫酸镁0.5-1.5份;蛋白胨1.5-2.5份;维生素出0.01-0.02份;水800-1000份。
[0005] 在上述技术方案的基础上，为了使所述培养基在保藏蜜环菌母种时有更好的表 现，本发明还可以做如下进一步优化。
[0006] 进一步，所述培养基由以重量份数的原料制成:木肩60份;麸皮40份;玉米粉40份； 磷酸二氢钾2份;硫酸镁1份;蛋白胨2份;维生素關.01份;水1000份。
[0007] 进一步，所述木肩由栗木粉碎而成，所述木肩的粒径为3_5mm。
[0008] 进一步，所述麸皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm。
[0009] 进一步，所述磷酸二氢钾及硫酸镁为分析纯，所述蛋白胨为生物试剂。
[0010] 本发明还提供上述用于保藏蜜环菌母种的培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0011] S1.配液:按照各原料的重量份数将所述木肩、麸皮和玉米粉加入水中并煮沸，再 按各原料的重量份数加入磷酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨及维生素 Bi，搅拌溶解得培养液；
[0012] S2 ·分装：将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为18mm X 180mm或20mm X 200mm 试管中，向试管内倒入培养液的时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖直放置，分装入试管 内的培养液的高度为试管高度的50-65%，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用塞子密 封；
[0013] S3.灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于121-128Γ的温度下灭菌35-45min， 自然冷却至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。
[0014]在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步优化。
[0015] 优选的，S2中使用的塞子为硅胶塞，S3中的灭菌温度为126°C，S3中的灭菌时间为 40min。使用硅胶塞的好处为，一是减少制作棉塞过程，二是硅胶塞在保藏中的保水性能好、 不易受潮发霉，三是用硅胶塞替换棉塞可减少石蜡封棉塞程序。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017] (1)采用本发明提供的培养基配方及方法制作的培养基更适宜蜜环菌生长和保 藏，该培养基为柱状，使用本发明提供的培养基进行蜜环菌保藏，保藏时间可达730天，也即 可达到两年的有效保藏期，而现有技术中的蜜环菌的保藏期只有三到四个月或半年到一 年，即本发明大大地延长了蜜环菌母种的保藏时间。
[0018] (2)采用本发明的培养基配方及方法制作的培养基进行蜜环菌保藏，蜜环菌母种 的种性不易退化:在两年的保藏期内，菌种试管底部仍呈白色、索状、分枝多、无褐变、无角 质化，表明此法保藏的菌种基本没有退化，品种性能在保藏中没有受到较大地影响。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实施例及对比例对本发明的进行进一步的详细描述，所举实例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0020] 本发明采用的方法未作特殊说明均为常规方法，本发明使用的试剂均为市售产 品。
[0021] 实施例1
[0022] -种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其制备方法包括如下步骤：
[0023] S1配液:将60g木肩、40g麸皮和40g玉米粉加入1000mL水中，加热煮沸，再加入2g磷 酸二氢钾、lg硫酸镁、2g蛋白胨及10mg维生素也，搅拌溶解得培养液，所述木肩由栗木粉碎 而成，所述木肩的粒径为3_5mm，所述麸皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm;
[0024] S2.分装:将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为18mm X 180mm (18是试管口径， 180为试管长度)试管中，向试管内倒入培养液的同时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖 直放置，分装高度为117mm(为试管高度的65%)，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用硅 胶塞密封；
[0025] S3.灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于126°C的温度下灭菌40min，自然冷却 至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。
[0026] 实施例2
[0027] -种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其制备方法包括如下步骤：
[0028] S1.混合:将55g木肩、36g麸皮和38g玉米粉加入800mL水中，加热煮沸，再加入1.5g 磷酸二氢钾、〇.5g硫酸镁、1.5g蛋白胨及lOmg维生素 m，搅拌溶解得培养液，所述木肩由栗 木粉碎而成，所述木肩的粒径为3_5mm，所述麸皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm;
[0029] S2.分装:将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为18mmX 180mm试管中，向试管 内倒入培养液的同时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖直放置，分装高度为90_(为试管 高度的50 % )，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用硅胶塞密封；
[0030] S3.灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于121°C的温度下灭菌45min，自然冷却 至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。
[0031] 实施例3
[0032] -种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其制备方法包括如下步骤：
[0033] S1.混合：将65g木肩、44g麸皮和42g玉米粉加入lOOOmL水中，加热煮沸，再加入 2.5g磷酸二氢钾、1.5g硫酸镁、2.5g蛋白胨及20mg维生素 m，搅拌溶解得培养液，所述木肩 由栗木粉碎而成，所述木肩的粒径为3_5mm，所述麸皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm；
[0034] S2.分装:将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为18mmX 180mm试管中，向试管 内倒入培养液的同时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖直放置，分装高度为99_(为试管 高度的55 % )，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用硅胶塞密封；
[0035] S3.灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于128°C的温度下灭菌35min，自然冷却 至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。
[0036] 实施例4
[0037] -种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其制备方法包括如下步骤：
[0038] S1.混合:将60g木肩、40g麸皮和40g玉米粉加入900mL水中，加热煮沸，再加入2g磷 酸二氢钾、lg硫酸镁、2g蛋白胨及10mg维生素也，搅拌溶解得培养液，所述木肩由栗木粉碎 而成，所述木肩的粒径为3_5mm，所述麸皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm;
[0039] S2.分装:将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为20mmX 200mm试管中，向试管 内倒入培养液的同时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖直放置，分装高度为l〇8mm(为试 管高度的54%)，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用硅胶塞密封；
[0040] S3.灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于126°C的温度下灭菌40min，自然冷却 至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。
[0041] 对比例1
[0042]与实施例1相比，不同点仅为木肩、麸皮和玉米粉的用量，在对比例1中其用量为木 肩80g、麸皮20g、玉米粉50g。
[0043] 对比例2
[0044] 与实施例1相比，不同点仅为木肩、麸皮和玉米粉的用量，在对比例1中其用量为木 肩35g、麸皮44g、玉米粉45g。
[0045] 对比例3
[0046] 与实施例1相比，不同点仅为木肩和麸皮的粒径不同，在对比例3中，木肩的粒径为 0.9-2.8mm，麸皮粒径为 0.5-0.8mm。
[0047] 对比例4
[0048] 与实施例1相比，不同点仅为木肩和麸皮的粒径不同，在对比例4中，木肩的粒径为 5.5-6mm，麸皮粒径为 2-2.36mm。
[0049] 对比例5
[0050] 与实施例1相比，不同点仅为灭菌温度和灭菌时间不同，在对比例5中灭菌温度为 135°C，灭菌时间为35min。
[0051 ] 对比例6
[0052] 与实施例1相比，不同点仅为灭菌温度和灭菌时间不同，在对比例6中灭菌温度为 110°C，灭菌时间为50min。
[0053] 对比例7
[0054]与实施例1相比，不同点为在对比例7中加入木肩、麸皮及玉米粉的同时，还加入 20g白砂糖。
[0055] 对比例8
[0056]与实施例1相比，不同点为在对比例8中加入木肩、麸皮及玉米粉的同时，还加入 20g葡萄糖。
[0057] 对比例9
[0058]与实施例1相比，不同点为在对比例9中加入木肩、麸皮及玉米粉的同时，还加入 20g马铃薯粉。
[0059] 对比例10
[0060] 与实施例1相比，不同点为在对比例10中加入的木肩由杨树经粉碎机粉碎而成。
[0061 ] 对比例11
[0062]与实施例1相比，不同点为在对比例11中加入木肩、麸皮及玉米粉的同时，还加入 20g琼脂。
[0063]由实施例1至4及对比例1至10制备出的用于保藏蜜环菌母种的培养基在同等条件 下按照标准操作接种蜜环菌母种，待其充分生长后，移至3_5°C环境下保藏并每隔一定的时 间观察菌种保藏情况，菌种的保藏时间和菌种的性状如下表所示：
[0064]
[0065] 由上表中实施例1至4的相应保藏结果可知，以本发明提供配方及方法制作的培养 基适用于保藏蜜环菌母种，有效保藏时间可达到两年;从表中对比例1至11的相应保藏结果 可知，当木肩、麸皮及玉米粉的用量不在本发明要求的用量范围内时，由于营养成份比例的 变化，最终使得有效保藏时间明显缩短，不足一年；当木肩、麸皮及玉米粉的粒径不在本发 明要求的范围内时，无论粒径过小或过大，最终的有效保藏时间均为受到影响，缩短至一年 半;灭菌温度过高或灭菌时间过长，会使培养基内的玉米粉老化，特别是灭菌温度过低，造 成灭菌不彻底，培养中先期污染，导致培养失败;培养基内若直接加白砂糖、葡萄糖或琼脂 等，也会明显缩短有效保藏时间；栗木换为杨木，有效保藏时间也会缩短，其可能原因为杨 木生长快，其木质营养成份少。
[0066] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其特征在于，由以下重量份数的原料制成:木肩 55-65份;麸皮36-44份;玉米粉38-42份;磷酸二氢钾1.5-2.5份;硫酸镁0.5-1.5份;蛋白胨 1 · 5-2 · 5份;维生素 Βι 0 · 01-0 · 02份;水800-1000份。2. 根据权利要求1所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其特征在于，由以重量份 数的原料制成:木肩60份;麸皮40份;玉米粉40份;磷酸二氢钾2份;硫酸镁1份;蛋白胨2份； 维生素0.01份;水1000份。3. 根据权利要求1或2所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其特征在于，所述木 肩由栗木粉碎而成，所述木肩的粒径为3-5_。4. 根据权利要求1或2所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其特征在于，所述麸 皮为大片麸皮，所述麸皮的粒径为1-1.7mm。5. 根据权利要求1或2所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基，其特征在于，所述磷 酸二氢钾及硫酸镁为分析纯试剂，所述蛋白胨为生物试剂。6. -种如权利要求1至5任一项所述的用于保藏蜜环菌母种的培养基的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤：51. 配液:按照各原料的重量份数将所述木肩、麸皮和玉米粉加入水中并煮沸，再按重 各原料的重份数加入磷酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨及维生素也，搅拌溶解得培养液；52. 分装:将S1制备的培养液通过漏斗分装至规格为18mmX 180mm或20mmX 200mm试管 中，向试管内倒入培养液的同时用玻璃棒将其按至试管底部，试管竖直放置，分装入试管内 的培养液高度为试管高度的50-65%，分装完成后擦净试管内壁及管口，并用塞子密封；53. 灭菌:将S2中分装完成并密封的试管置于121-128Γ的温度下灭菌35-45min，自然 冷却至室温，即得用于保藏蜜环菌母种的培养基。7. 根据权利要求6所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基的制备方法，其特征在于， S2中使用的塞子为硅胶塞。8. 根据权利要求6或7所述的一种用于保藏蜜环菌母种的培养基的制备方法，其特征在 于，S3中的灭菌温度为126°C，S3中的灭菌时间为40min。
【文档编号】C12N1/14GK106085870SQ201610440586
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】杨辉德, 姜莉莉, 周桃英
【申请人】黄冈职业技术学院