专利名称：利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用组织培养技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，属
于作物栽培领域。
背景技术：
连作障碍是一个世界性难题，通常是指同一作物或近缘作物连作以后，即使在正常管理的情况下，也会产生产量降低、品质变劣、生育状况变差的现象。连作障碍在非禾本科作物中比较突出，随着设施农业的发展，连作障碍已经成为急需解决的栽培难题。 研究表明连作栽培常导致土壤理化性质发生改变，矿质元素失去平衡，有毒有害物质积累，更重要的是土壤微生物群落的自然平衡遭到破坏。 一些有益微生物的生长受到抑制，而有害微生物迅速蔓延，致使同种作物的生长受抑，种植效益急剧下滑。
近年来，由于分析技术的进步，有关自毒性成分的研究报道越来越多。它们主要是一些酚酸类成分，通过影响作物的多种生理活动而抑制作物生长。如果能够有效清除这类自毒性成分，那么将显著改善作物的根际环境，提高单位土地的生产力。
土壤中酚酸类成分主要来源于作物残体的降解和根系分泌物，其清除主要靠土壤微生物降解或转化为腐植酸。腐殖酸是土壤有机质的主体，通常占80%以上。它在土壤中可起到稳定土壤团粒结构，缓冲土壤酸碱变化，促进作物生长和微生物活动，协调水、肥、气、热矛盾，提高通气透水和保水保肥能力，因此被称为"土中之宝，肥中精华"。 腐殖酸分为两大类，即褐腐酸和黄腐酸。当细菌活动旺盛时，形成的褐腐酸较多；当真菌活动旺盛时，形成的黄腐酸较多。褐腐酸有利于植物生长，而黄腐酸溶解性强，可造成土壤营养元素流失，降低土壤肥力，从而不利于后茬作物生长。因此针对连作障碍，可以通过人工干预措施，施用有益细菌，促使作物根系发育，加快酚酸类成分降解，改善根际微生态，最终达到稳产增产的目的。 目前经销的有益微生物制剂从不同途径取得，针对性不强，不能适应各地土壤条件，是否能在土壤中定植尚难以确定，更严重的是，微生物经过多代繁殖，其发生变异的几率很大，优良性状易于丧失。因此快速而有针对性地分离有益微生物的技术是通过有益微生物治理作物连作障碍的关键。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种快速而有针对性地分离有益微生物的技术，即一种利用组织培养技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的 —种利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，步骤如下
l)建立目标作物的组织培养体系 得到无性繁殖的试管苗；
2)从目标作物适宜种植的土壤中或目标作物体表分离得到不同的细菌菌株；
3)制备作物提取物所述作物提取物是指目标作物整体或任何部位的任何溶剂所提取的溶液或其干燥物； 4)在目标作物的组织培养体系中接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，观察、评价各菌株对试管苗生长发育的影响；有的能促进试管苗的生长，有的抑制或导致试管苗死亡，还有的影响不显著； 5)在目标作物的组织培养体系中添加作物提取物，培养一段时间后，试管苗有可能在添加作物提取物的培养基中逐渐枯死，难以生长，接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，观察、评价试管苗生长发育情况，有的菌株能使试管苗恢复生长；
6)在培养基中添加根际土壤常见有机酸，并接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，定期测定培养基中有机酸的含量； 7)综合分析，满足以下三个条件之一的菌株即可认为是有益细菌菌株
a步骤4)中能促进试管苗生长的菌株； b步骤5)中能促进试管苗生长的菌株；或因添加作物提取物而使试管苗难以生
长，而接种后能使试管苗恢复生长的菌株； c步骤6)中能使有机酸含量显著下降的菌株； 确定有益细菌菌株后，采用常规细菌发酵技术生产有益菌制剂，用于大田预防和治理作物的连作障碍； 以上步骤并无严格顺序限制，可自由调整，上述1) 7)仅为方便描述，并非顺序上的限制。 本发明利用了组织培养技术，避免了各种环境因素的影响，不受气候和季节的限制，筛选有益细菌的速度得到了显著的提高；筛选过程中，所用菌株直接来自产区土壤，完全适应当地土壤环境，同时，以土壤菌株对目标作物残体胁迫的缓解能力以及对酚酸类成分的降解能力作为评价指标，所确定有益菌的针对性显著增强。总之，本发明的方法有效实用，可行性高，适用于大多数作物的有益菌的筛选。
图l为不同菌株对地黄试管苗生长的影响示意图，其中，24号菌促进，35号抑制，37号致死。 图2为地黄提取物对地黄试管苗生长的影响示意图，其中，上图为添加地黄提取物者，下图为对照； 图3为地黄提取物对地黄试管苗叶片SOD、 CAT、 POD和APX活性的影响直方图，其中，横坐标中0、 1、 2、 3、 4的含义为每50mLMS培养基中添加0.00， 0.75，1.50， 2.25， 3.00mL10X的地黄根系提取液； 图4为有益菌对地黄提取液所致胁迫的缓解作用示意图，其中，用地黄根系提取液替代MS培养基中的蔗糖，左接种6号菌株，右未接种细菌，作为对照。
具体实施例方式下面结合克服地黄连作障碍有益细菌的筛选对本发明作进一步的说明
地黄是一种大宗常用中药材，其年需求量达2300-2500万公斤。《齐民要术》中就已经记载了 "种地黄法"。地黄栽培实践证明，其连作障碍十分严重，早在明代就有记载"种植之后，其土便苦……。足十年，土味转甜，始可复种地黄。否则味苦形瘦，不堪入药也"。河南是传统的地黄种植区，但由于连作障碍，主产地已转移到周边省区，如山西、河北和山东。 本实例首先通过地黄茎尖培养得到了地黄试管苗，其培养基为MS培养基，其中添加0.2ppm的6-BA。然后利用葡萄糖铵盐培养基从山东适宜产区未种植过地黄的耕作层土壤中分离得到50个细菌菌株，将其分别接种于地黄试管苗基部，发现有的菌株促进试管苗的生长，有的抑制或导致试管苗死亡，还有的影响不显著，如图1所示。选对地黄试管苗具有促进作用的菌株作为初选有益菌。 地黄根系中含有大量水苏糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖和果糖等。根据含量折算，用60克地黄根系的水提液替代一升MS培养基中的蔗糖，以评价地黄根系提取液对地黄试管苗生长的影响。结果培养30天后发现地黄试管苗在添加地黄根系提取液的培养基中逐渐枯死，难以生长，而不添加地黄根系提取液的对照组生长良好，如图2所示。 于MS培养基中添加少量地黄根系提取液时，发现地黄根系提取液剂量依赖性地导致地黄试管苗叶片的抗氧化酶(SOD、 CAT、 POD和APX)活性下降，如图3所示。
将对试管苗具有促进作用的初选有益菌接种到用地黄根系提取液替代蔗糖的MS培养基中时，发现有的菌株对试管苗的生长状况无改善，而有的可使地黄试管苗恢复生长，如图4所示。将能克服地黄根系提取物所导致胁迫作用的菌株作为再选有益菌，用于进一步筛选。 在葡萄糖铵盐培养液中添加地黄根际土壤中积累比较多的6种酚酸类成分，以不加者为对照，分别接种所筛选的8个再选有益菌株，2『C培养12h，结果发现不添加酚酸的对照培养液中无酚酸的吸收峰，说明菌株本身不产生酚酸，而添加菌株者，其含量显著下降，结果如表l所示。由于8个菌株对有机酸的降解能力各有优势，因此将这8个菌株均作为能够克服地黄连作障碍的有益菌。
表l.8个有益菌株对6种酚酸的降解率(％ )
，株— 6 7 2328 一2"^ S 43 根据以上方法，从适宜产区土壤中分离得到8个有益菌，用PDA培养基分别斜面固体培养，然后经过摇床和发酵罐放大培养，混合后作为有益细菌菌液，于地黄种植时浸种，秋季收获时，连作地块单产提高49.5%，与非连作地块单产无显著差异。
该实例充分说明利用本发明筛选的有益细菌菌株可以克服地黄的连作障碍，也
o 3
8 2
3 3
7* o
7 3
2 3
6 4
2 6
6 4
3 3
9 8
6 2
7 9
3
9
2
3
2
5 9
2 3
3 7
4 2
o 3
4 4
2
4*
7
o 9 6 6
5 3 13
6
2 8
3 3
9 6
4 8
4 2
2 5
2
9 9
2 3
7 o
7 3
o 7
7
2
2 9
2 7
甲
苯
基酸酸酸酸酸
羟草啡香豆甲
对香咖了香苯
5说明本筛选方法的可行性c
权利要求
一种利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，其特征在于，步骤如下1)建立目标作物的组织培养体系，得到无性繁殖的试管苗；2)从目标作物适宜种植的土壤中或目标作物体表分离得到不同的细菌菌株；3)制备作物提取物所述作物提取物是指目标作物整体或任何部位的任何溶剂所提取的溶液或其干燥物；4)在目标作物的组织培养体系中接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，观察、评价各菌株对试管苗生长发育的影响；5)在目标作物的组织培养体系中添加作物提取物，培养一段时间后，接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，观察、评价试管苗生长发育情况；6)在目标作物的组织培养体系的培养基中添加根际土壤常见有机酸，并接种步骤2)中得到的不同细菌菌株，定期测定培养基中有机酸的含量；7)综合分析，满足以下三个条件之一的菌株即可认为是有益细菌菌株a步骤4)中能促进试管苗生长的菌株；b步骤5)中能促进试管苗生长的菌株；或因添加作物提取物而使试管苗难以生长，接种后能使试管苗恢复生长的菌株；c步骤6)中能使有机酸含量显著下降的菌株；确定有益细菌菌株后，采用常规细菌发酵技术生产有益菌制剂，用于大田预防和治理作物的连作障碍；以上步骤并无严格顺序限制，可自由调整，上述1)～7)仅为方便描述，并非顺序上的限制。
2. 根据权利要求1所述的利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，其特 征在于所述步骤3)中，作物提取物为作物全株、根、茎或叶的水或有机溶剂提取液。
3. 根据权利要求1所述的利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，其特 征在于所述步骤6)中，根际土壤常见有机酸包括对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁 香酸、香豆酸以及苯甲酸等。
4. 根据权利要求1所述的利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，其特 征在于所述步骤7)中，综合评价时，评价的指标包括作物试管苗的高度、颜色、重量
全文摘要
本发明公开了一种利用组培技术筛选克服作物连作障碍有益细菌的方法，步骤如下先建立目标作物的组织培养体系，并分离细菌菌株、制备作物提取物，然后向目标作物的组织培养体系中接种细菌菌株，并添加作物提取物，观察其对培养物的影响情况，然后进行综合分析，确定有益细菌菌株，然后采用常规细菌发酵技术生产有益菌制剂，用于大田预防和治理作物的连作障碍。本发明利用了组织培养技术，避免了各种环境因素的影响，不受气候和季节的限制，筛选有益细菌的速度得到了显著的提高；本发明以土壤菌株对目标作物残体胁迫的缓解能力以及对酚酸类成分的降解能力作为评价指标，所确定有益菌的针对性显著增强。
文档编号C09K17/00GK101691600SQ20091001945
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者刘峰, 温学森, 王雪翠, 马成涛 申请人:山东大学