专利名称：一种从萝卜发酵液中分离花色苷色素和乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及ー种同时提取色素和乳酸的方法，特别涉及从萝卜发酵液中同时提取萝卜花色苷色素和乳酸的方法。
背景技术：
红萝卜(Radish)为十字花科 (Cruciferae)萝卜属(Raphanus L)萝卜的一类，品种丰富，例如从呈色特点可分为红皮白心、红皮红心、绿皮红心萝卜等。红萝卜富含花色苷色素，俗称萝卜红色素，以在我国作为天然食品添加剂获得批准。因而富含红色素的萝卜作为上色物质在传统和现代发酵エ业中得以广泛使用。相对于人工红色素而言，萝卜红色素具有安全可靠、无毒副作用、色调自然、具有一定药理作用和营养功效等优点。除了色素物质，萝卜发酵液富含着价值极高的乳酸。它是ー种多用途的精细化学品，可广泛用于食品、制药、环保、农业等行业。而且其产品主要表现形式为酸味剂、调味剂、防腐剤、鞣制剂、植物生长调节剂、生物可降解材料和手性药物等。但目前在萝卜发酵液在发酵完成后即被作为エ业废水处理，不仅资源浪费，也造成环境污染。经文献检索，尚无关于萝卜发酵液中色素和乳酸综合利用方面的相关文献专利报道。因此，本专利的核心内容是萝卜发酵废弃液中花色苷色素和乳酸的高值化利用。关于制备萝卜红色素的方法主要提取和合成。中国专利(CN1241599)，对红萝卜的浸提液进行果胶酶处理，然后过柱吸附分离纯化色素，然后脱色收集红色液体，经过真空压缩和喷雾干燥获得萝卜花色苷色素。中国专利(CN1510086)，对新鲜的红萝卜浸提萃取，然后用树脂吸附，最后经喷雾干燥浓缩，真空混合干燥和脱除异味处理得到萝卜红色素粉末。中国专利(CN101525498)，将萝卜预热压榨，然后进行酶解，再用壳聚糖的吸附性脱除臭味，浓缩干燥得到萝卜花色苷色素粉末。中国专利(CN102093748A)以红心萝卜为原料，经提取、脱蛋白质、脱萝卜硫苷、超滤纯化、浓缩、喷雾干燥而制得萝卜红色素单聚体和萝卜原花青素产品。中国专利(CN101775233A)，对红心萝卜浸提，然后微滤、超滤、纳滤，制得高纯度的萝卜花色苷色素。在乳酸的提取制备方面，中国专利(CN1603298)公布了ー种从发酵液中提取乳酸的エ艺方法，即利用活性炭与H-103树脂脱色除糖，两次降温，一次结晶得到乳酸钙，所得到的乳酸钙结晶率可达80%，纯度达97. 2%。中国专利(CN101294169)，采用公布了一种新的中和剂进行发酵，将淀粉原料调浆接种进行发酵产生乳酸钠，然后进行超滤，膜析生成乳酸和氢氧化钠，回收乳酸浓缩得到产品。中国专利(CN1226601)，公布了ー种从酒厂废水中提取乳酸钙的方法，将废水加入一定量的黄水混匀发酵，然后加入石灰水沉降，进行过滤，最后浓缩洁净，本发明对乳酸钙的提取率为81. 0%以上，且操作简便，成本低廉。由上述可以看出，萝卜花色苷色素的提取多是采取直接对新鲜红萝卜进行浸提萃取而得到，而乳酸的制备一般采取发酵法，但是采用一套分离、提取流程来同时分离萝卜花色苷色素和乳酸的エ艺还未实现。我国毎年胭脂萝卜的产量上千万吨，其中很大一部分用来制作泡菜，我国泡菜生产エ艺和新技术开发有很好的发展。然而，泡菜经过发酵后的发酵液却是丢弃的，不仅造成排放污染，而且其中含有的大量的色素和乳酸都浪费了。本发明旨在设计ー套エ艺流程，通过乳酸发酵，分离制备萝卜花色苷色素和乳酸。该エ艺也适用于我国泡菜エ业，即高值化利用发酵废弃液中花色苷色素和乳酸。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种从萝卜发酵液中同时提取萝卜花色苷色素(以下简称色素)和乳酸的方法，所述方法エ艺简単、绿色环保。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种从萝卜中同时提取萝卜花色苷色素和乳酸的方法，包括如下步骤(I)菌种活化扩培
乳酸菌的活化将冷冻植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(菌号CICC22696,购于中国科学院微生物研究所)的菌种解冻后，挑出2 3环接种到300mL 土豆培养基上，在30°C培养18 24h ；乳酸菌的扩培按体积比5%，将以上富含活化菌种的土豆培养基扩培到新的土豆培养基中，在30°C培养18-24h即可用于萝卜接种；所述土豆培养基制作方法煮沸500mL水，然后称取洗净并切好的土豆块120g，煮沸并保温30分钟，然后进行过滤，再加入12g白砂糖，将滤液分装入两个锥形瓶，每个用去离子水定量到300mL ;然后用包有纱布的橡皮塞封住瓶ロ，再用报纸包裹起来，并用橡皮筋捆好，放入灭菌锅灭菌2小时左右。(2)预处理、发酵将萝卜洗浄、削皮，然后在95 100°C水中烫漂3 7min进行灭酶，优选萝卜烫漂灭酶时间为3min，加热后迅速冷却到10 20°C ;灭酶后的萝卜皮和8g/100mL的无菌盐水按照3 6 7的质量/体积比(g/ml)装入已灭菌的发酵罐中，二者比例优选3 7;接着，按体积比5%，将已活化扩培后的植物乳杆菌接种到发酵罐里；⑶发酵终止发酵7 14天后，收集发酵液，并进行高温(90_121°C )灭菌处理；(4)初步纯化将发酵液离心(lOOOOg，4°C，5 IOmin)，收集上清液；(5)萝卜花色苷色素和乳酸的分离利用高分子填充材料(大孔吸附树脂或C18树脂)层析柱，采取吸附分离法来获得色素和乳酸的分离，随后用こ醇水溶液(80-100%，v/v)解吸色素，从而分离(4)中所述上清液的色素和乳酸。具体步骤为用盐酸(6mol/L)将⑷中所述上清液pH值(3. 4
3.5)调整到pH <3得到酸化的上清液；按照酸化的上清液、含0.01%的盐酸(v/v)去离子水、含0.01%的盐酸(v/v)こ醇水溶液进行加样，分别收集洗脱液こ醇收集液⑷富含色素物质，其他收集液(B)富含乳酸物质；所述大孔吸附树脂为XAD-7HP(比表面积为500m2/g ;平均孔径为450 A ;平均粒径为560 u m ;偶极距为I. 8 ;均一系数D90/D40为I. 7);所述C18树脂为Lichrospher反相RP-18填料(孔径100A，粒径25-40 u m);所述层析柱大小为015x250 mm或IOmL和2mL 一次性注射针筒作为小样分离的层析柱；(6)萝卜花色苷色素和乳酸的精制
经上述树脂分离得到洗脱液，将こ醇收集液(A)离心(10000g，4°C，5 IOmin)，收集上清液，真空浓缩至体积小于原有体积的四分之一；再对该浓缩液进行离心(lOOOOg，4°C，5 lOmin)，收集上清液，加入こ醇或こ醇水溶液，使最終こ醇浓度大于80% (v/v)，进行醇沉、离心(lOOOOg,4°C, 5 IOmin)、蒸发浓缩至体积小于原有体积的四分之一,如此反复I 4次，然后蒸干得到暗红色粉末即所述萝卜花色苷色素；将其他收集液(B)进行浓缩、离心(10000g，4°C，5 lOmin)，收集上清液，然后用こ醇进行醇沉，离心(lOOOOg,4°C,5 IOmin)，收集上清液，再进行浓缩至除去所有こ醇，即得到纯化的乳酸浓缩液，通过真空干燥或冷冻干燥得到粉末物质即所述乳酸。在上述步骤(5)中分离色素和乳酸时，由于乳酸的水溶性很强，理论上与和非极性极强的树脂亲和カ很弱，所以在树脂里的吸附量较少；相对于乳酸而言，色素非极性较強，树脂对色素的吸附性強。因此，在水溶液体系里色素会被吸附在树脂上，而乳酸不会被吸附在树脂上。本发明所述萝卜为含有花色苷色素的萝卜，如红皮白心萝卜、红皮红心萝卜、绿皮
红心萝卜等。本发明的优点是根据萝卜花色苷色素(以下简称色素)和乳酸的物化性质，建立红萝卜发酵液中色素和乳酸的分离制备エ艺，该エ艺制得的色素和乳酸得率高、分离效果好、且エ艺简便。利用树脂对色素和乳酸的选择吸附性，C18树脂材料和大孔吸附树脂材料达到分离效果色素得率分别为90. 8% (C18树脂)和94. 0% (大孔树脂)，最后采取旋转蒸发将浓缩液蒸干制得色素粉末，其为暗红色粉末，得率为84. 5%以上，纯度达到2. 6%(w/w)以上；乳酸得率为89. 9% (C18树脂)和81. 0% (大孔树脂)，纯度达到53. 3% (w/w)以上。
图I为萝卜发酵液花色苷色素和乳酸制备エ艺流程。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体描述，但是本发明技术方案不局限于以下所列举的实施方式。以下实施例中所用大孔吸附树脂为XAD-7HP (比表面积为500m2/g，平均孔径为450 I，平均粒径为560 iim，偶极距为I. 8，均一系数D90/D40为1.7);所用C18树脂为Lichrospher反相RP-18填料(孔径100A,粒径25-40 V- m);所用层析柱大小为
015 ><250 mm , 以下实施例中所用土豆培养基制作方法为煮沸500mL水，然后称取洗净并切好的土豆块120g，煮沸并保温30分钟，然后进行过滤，再加入12g白砂糖，将滤液分装入两个锥形瓶，每个用去离子水定量到300mL ;然后用包有纱布的橡皮塞封住瓶ロ，再用报纸包裹起来，并用橡皮筋捆好，放入灭菌锅灭菌2小时左右。以下实施例中制备步骤如图I所示。实施例I将冷冻的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(菌号CICC 22696)接种到300mL 土豆培养基上解冻活化，培养18 24h。按体积比5%，将以上富含活化菌种的土豆培养基扩培到新的土豆培养基中，在30°C培养18 24h即可用于萝卜接种；将红皮白萝卜洗浄，削皮，然后100°C烫漂7min，灭酶后的萝卜皮和8g/100mL的无菌盐水按照300g 600mL的质量/体积比装入已灭菌的发酵罐中，按体积比5%，将已活化扩培后的植物乳杆菌接种到发酵罐里；发酵7天，收集发酵液，并进行高温(90 121°C)灭菌处理；将发酵液离心(lOOOOg，4°C，IOmin)，收集上清液(为纯化前花色苷和乳酸混合物，表I);用36g大孔吸附树脂填充装柱，然后按照50mL酸化的发酵液，50mL含0. 01 %盐酸(v/V)的去离子水、IOOmL含0. 01%盐酸(v/v)的无水こ醇的顺序进行加样和洗脱液，分别收集洗出液，こ醇收集液(A)富含色素物质，其他收集液(B)富含乳酸物质；将IOOmLこ醇收集液(A)离心(lOOOOg，4°C，IOmin)，收集上清液，进行蒸发浓缩至10 20mL，然后离心(lOOOOg，4°C，IOmin)，取出上清液，加入40 80mL无水こ醇进行醇沉、然后离心(10000g，4 °C, I Omin),蒸发浓缩至10 20mL,如此反复3 4次至无明显沉淀,然后蒸干剩余液体，得到暗红色色素粉末(为纯化处理后的花色苷，表I);将IOOmL发酵液和去离子水收集液(B)浓缩、离心(lOOOOg，4°C，IOmin)，收集上清液，然后用こ醇进行醇沉，离心(lOOOOg, 4°C, IOmin)，收集上清液，再进行冷冻干燥，即得到富含乳酸的固体物质(为纯化处理后的乳酸样品，表I)。实施例2萝卜烫漂灭酶时间为3min，其他步骤同实施例I。实施例3萝卜皮与8g/100mL的无菌盐水的质量/体积比例为300g 700mL，其他步骤同实施例I。实施例4发酵液在纯化、精制过程的离心处理时间为5min，其他步骤同实施例I。
实施例5利用C18树脂吸附分离制备发酵液色素和乳酸的过程中，按照IOOmL酸化的发酵液，IOOmL含0.01%盐酸(v/v)的去离子水和200mL含0. 01%盐酸(v/v)的无水こ醇的顺序进行加样和洗脱液，其他步骤同实施例I。实施例6将实施例5中的去离子水的量改为150mL，其他步骤同实施例I。实施例7前面步骤同实施例I，在分离纯化过程中，大孔树脂填充量改为3. 6g，用IOmL注射针筒作为层析柱，然后5mL酸化发酵液、5mL酸化去离子水、IOmL酸化的无水こ醇的量依实施例I中的相应比例改变，收集こ醇收集液(A)和酸化发酵液、酸化去离子水收集液(B)，分别测定收集液A、B中的萝卜花色苷色素和乳酸含量。实施例8用C18 (0. 5g)树脂替代实施例7大孔吸附树脂，用2mL注射针筒作为层析柱，然后按照ImL酸化的发酵液、ImL酸化的去离子水、2mLこ酸こ酷、2mL酸化的无水こ醇的顺序进行加样和洗脱液，其他同实施例7。
实施例9
将200mL萝卜花色苷色素洗出液如实施例I中醇沉处理后，浓缩至10 20mL，其他步骤同实施例1，然后在_80°C下预冻18 24h，再进行冷冻干燥。性能测试实验I、萝卜花色苷色素含量的測定将发酵液分别用pH I. 0,0. 025M的氯化钾缓冲溶液和pH 4. 5,0. 4M的醋酸钠缓冲溶液稀释10倍(每300 u L稀释到3mL)，在UV-1800紫外分光光度计下分别检测520nm和700nm吸收光度值A。然后按如下公式计算萝卜花色苷色素的含量式中卿麵(的=。』》ヘ证補_4』
DF——稀释倍数；MW-分子量 ’萝卜中含有的花色苷主要是天竺葵色素，因此MW为天竺葵色素的
分子量，即433. 2 ；e-天竺葵色素的摩尔吸光系数,其值为31600 ；I-光程，Icm ；pigment为萝卜花色苷色素。配制pH值1.0、0.025M的氯化钾缓冲溶液准确称取I. 86g氯化钾，加入980mL的蒸馏水，測定PH值，用浓盐酸调节pH值到1.0，用蒸馏水定容到1.0L。配制pH值4. 5、0. 4M的醋酸钠缓冲溶液准确称取54. 43g的三水醋酸钠，溶解在960mL的蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值到4. 5，用蒸馏水定容到I. 0し2、乳酸含量的测定用Agilent 1260型高效液相色谱仪测乳酸含量。液相条件为Aligen ZORBAXSB-Aq柱子(150 X 4. 6mm，5 iim)，检测波长为210nm，流速为0. 8mL/min，进样量30ul，流动相组成为A相(甲酸甲醇水=0. I 3 96.9，v/v/v)和B相(こ臆)，梯度洗脱条件为0 5min 100% A 相；5 20min 100% -50% A 相；20 20. Olmin 50% -100% A相；20. 01 28min 100% A相。用HPLC以L-乳酸标品(Sigma，质量纯度98% )来制作乳酸标准曲线。测试结果实施例I 9中，通过改变了ー些条件的用量，但是所得到的结果相差不大。实施例2中烫漂时间的改变，实施例3中接种比例的改变，最终得到的红萝卜发酵液材料中的色素和乳酸的含量并没有太明显差异。实施例4中离心时间的改变，会导致离心效果不如IOmin的好。实施例5和6中加样量的相应改变并未影响到色素和乳酸的分离效果，回收率也较为稳定。实施例7说明量变小，重现性较好。实例8选用C18树脂，得到的类似结果。实例9增加萝卜发酵液处理量，并对萝卜花色苷色素洗出液进行冷冻干燥，色素粉末中花色苷纯度为3. 36% (w/w) 0以实施例I为例，通过旋转蒸发能够得到暗红色的粉末，乳酸经过醇沉后、干燥后的数据如表I所示表I实施例I中花色苷和乳酸的纯度及回收率
权利要求
1.一种从萝卜中同时提取萝卜花色苷色素和乳酸的方法，包括如下步骤 (1)菌种活化扩培 乳酸菌的活化将购买于中国科学院微生物研究所，菌号为CICC22696的冷冻植物乳杆菌的菌种解冻后，接种到300mL 土豆培养基上，在30°C培养18 24h得富含活化菌种的土豆培养基； 乳酸菌的扩培将所述富含活化菌种的土豆培养基扩培到新的土豆培养基中，在30°C培养18-24h即可用于萝卜接种； (2)预处理、发酵 将萝卜洗浄、削皮，然后在95 100°C水中烫漂3 7min进行灭酶，加热后迅速冷却到10 20°C;灭酶后的萝卜皮和8g/100mL的无菌盐水按照3g : 6 7ml的质量体积比装入已灭菌的发酵罐中；接着，按体积比5%，将扩培后的植物乳杆菌接种到发酵罐里； (3)发酵终止 发酵7 14天后，收集发酵液，并进行高温灭菌处理； (4)初步纯化 将灭菌后的发酵液离心，收集上清液； (5)萝卜花色苷色素和乳酸的分离 用6mol/L的盐酸将所述⑷中上清液pH值调整到pH < 3得到酸化的上清液，然后利用高分子填充材料层析柱分离色素和乳酸，加样顺序依次为所述酸化的上清液、含.0.01% (v/v)盐酸的去离子水、含0. 01% (v/v)盐酸的こ醇水溶液，分别收集洗脱液こ醇收集液(A)富含色素物质，其它收集液(B)富含乳酸物质，所述こ醇水溶液的浓度为80 100% (v/v)； (6)萝卜花色苷色素和乳酸的精制 将所述こ醇收集液(A)离心，收集上清液，真空浓缩至体积小于原有体积的四分之一，再进行离心，收集上清液，加入こ醇或こ醇水溶液，使最終こ醇浓度大于80% (v/v)，进行醇沉、离心、蒸发浓缩至体积小于原有体积的四分之一，如此反复I 4次，然后蒸干得到暗红色粉末即所述萝卜花色苷色素；将所述其它收集液(B)进行浓缩、离心，收集上清液，然后用こ醇进行醇沉，离心，收集上清液，再进行浓缩至除去所有こ醇，即得到纯化的乳酸浓缩液，通过真空干燥或冷冻干燥得到粉末物质即所述乳酸。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述(I)中所述300mL土豆培养基上接种量为2 3环，所述富含活化菌种的土豆培养基与所述新的土豆培养基的体积比为5%。
3.如权利要求I所述的方法，其中，所述土豆培养基制作方法为煮沸500mL7jC，然后称取洗净并切好的土豆块120g，煮沸并保温30分钟，然后进行过滤，再加入12g白砂糖，将滤液分装入两个锥形瓶，每个用去离子水定量到300mL ;然后用包有纱布的橡皮塞封住瓶ロ，再用报纸包裹起来，并用橡皮筋捆好，放入灭菌锅灭菌2小时左右。
4.如权利要求I所述的方法，其中，所述⑵中萝卜烫漂灭酶时间为3min。
5.如权利要求I所述的方法，其中，所述(2)中，所述萝卜皮和所述8g/100mL的无菌盐水按照3g 7ml的比例装入已灭菌的发酵罐中。
6.如权利要求I所述的方法，其中，所述(5)中所述高分子填充材料为大孔吸附树脂或C18树脂。
7.如权利要求I所述的方法，其中，所述离心条件为10000g，4°C，5 lOmin。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述大孔吸附树脂为XAD-7HP。
9.如权利要求6所述的方法,其中，所述C18树脂为Lichrospher反相RP-18填料。
全文摘要
本发明公开了一种从萝卜发酵液中同时提取花色苷色素和乳酸的方法，所述方法通过利用植物乳杆菌对萝卜进行发酵，并通过柱层析对发酵液进行分离从而可同时提取到花色苷色素和乳酸；所述方法制得的色素和乳酸得率高、分离效果好、且工艺简便，适合工业上大规模制备。
文档编号C09B61/00GK102827894SQ201210285489
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者敬璞, 董英, 方池, 赵淑娟, 叶天 申请人:上海交通大学