一株紫外诱变型荧光假单胞菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株兼具解磷和生物防治数种土传病害功效的紫外诱变型荧光假单胞菌F1。本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1的小麦全蚀病防效达到85-100％、辣椒青枯病防效达到70-90％，解磷效果达到480-552mg/L，比野生菌株提高40％。
【专利说明】一株紫外诱变型荧光假单胞菌及其用途 【【技术领域】】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】。更具体地，本发明涉及一株紫外诱变型荧光假单胞 菌（Pseudomonas florescens, Ρ· florescens)F1 及其应用。 【【背景技术】】
[0002] 磷是植物生长发育的必需营养元素之一，参与植物的光合作用及体内的生化反应 过程。磷在大气中没有稳定的气态化合物，它的循环方式是一种典型的沉积式循环。植物 所利用的磷素主要来源于土壤，我国土壤耕层的全磷含量为〇. 4?2. 5g/kg，但是植物可利 用的有效磷不足全磷的1 %。解磷微生物广泛分布于土壤并在自然磷循环中具有中心地位， 解磷微生物可以将难溶性磷素转化为可溶性磷供给植物生长所需，因此，解磷微生物的应 用可提高磷肥利用率，并能够改善土壤环境。
[0003] 在众多解憐微生物中Pseudomonas florescens (P. florescens)具有较强的解 磷作用，CN 201310079130公开了一株荧光假单胞菌，它的解磷量可达到424. 92mg/L ; CN 201310368621涉及一株荧光假单胞菌，它在蒙金娜无机磷液体培养基的解磷量可达 579. 4mg/L〇
[0004] 荧光假单胞菌为革兰氏阴性好氧细菌，其营养需求相对简单，能够利用植物根分 泌的大部分养分迅速定殖于植物的根部，是最有潜力的促进植物生长的根际微生物。另外， 荧光假单胞菌由于能够分泌抗生素、噬铁素等有效因子，具有显著的植物土传病害的防治 效果，尤其对小麦全蚀病（CN201110266283)、番茄青枯病（CN 201010608662)、辣椒疫霉病 (CN201310075560)防效显著。
[0005] 已报道的荧光假单胞菌具有单一的生防功能或单一的解磷功效，兼具解磷和生防 功效荧光假单胞菌尚未见报道。 【
【发明内容】
】
[0006] [要解决的技术问题]
[0007] 本发明的目的是提供一株紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens) FI 〇
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述紫外诱变型荧光假单胞菌FI的用途。
[0009] [技术方案]
[0010] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0011] 本发明涉及一株紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens) FI，它已于2014年2月17日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC N0. 8820。
[0012] 本发明还涉及所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1的培养方法。该培养方法的步 骤如下：
[0013] A、斜面培养
[0014] 使用接种环将紫外诱变型荧光假单胞菌F1接种于试管斜面培养基中，然后置于 恒温培养箱中在温度28?30°C的条件下培养24?48h，得到一种斜面培养物；所述试管斜 面培养基的组成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、18?20g/L琼脂与1000ml 蒸馏水，pH值7.0?7. 2;
[0015] B、液体培养
[0016] 将4?5环在步骤A得到的斜面培养物接种到NB液体种子培养基中，然后置于恒 温振荡培养箱中在温度28?30°C与转速180rpm的条件下振荡培养24?48h，得到一种含 有80?100亿/ml紫外诱变型荧光假单胞菌F1的发酵培养物；所述的NB液体种子培养基 组成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨与5g/L氯化钠与1000ml蒸馏水，pH7. 0?7. 2。
[0017] 本发明还涉及所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1在农业生产中的用途。
[0018] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于溶解 在土壤中的不溶磷酸盐。
[0019] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述土壤的不溶磷酸盐是磷酸一钙、磷酸二 钙、磷酸三钙或氧基磷灰石。
[0020] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1按照 lml/100g施用到土壤中，其解磷能力达到25?40mg/kg。
[0021] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于防 治在土壤中的土传病害。
[0022] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的土传病害是小麦全蚀病、辣椒青枯病、 姜瘟病、三七根腐病或茶叶炭疽病。
[0023] 根据本发明的另一种优选实施方式，使用所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1发 酵培养物按照150ml/亩对小麦种子拌种，小麦全蚀病的防治效果达到85?100%。
[0024] 根据本发明的另一种优选实施方式，使用所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1发 酵培养物按照5L/亩/次，冲施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果达到70?90 %。
[0025] 下面将更详细地描述本发明。
[0026] 本发明涉及一株紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens)Fl，它已于2014年2月17日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC N0. 8820。
[0027] 按照下述步骤从土壤中分离得到紫外诱变型荧光假单胞菌F1 :
[0028] A、采用稀释平板法（蒙金娜无机磷固体培养基）从小麦全蚀病的衰退土壤中分离 解磷菌，挑取野生型解磷菌F0单菌落，接入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠组成 的NB培养基（pH7. 0?7. 2)中，在温度28?30°C与转速180rpm的条件下培养16?20h， 得到一种培养物；
[0029] 然后，将2ml所述培养物加到直径75mm的无菌培养皿中，然后置于功率20W的紫 外灯下，在距离紫外灯30cm处照射90s，接着在黑暗中将受照射菌液稀释至ΚΓ 6,然后涂 布在由 10. 0g/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 · 7Η20、0· 3g/L NaCl、0. 3g/L KC1、 0· 03g/L FeS04 · 7Η20、0· 03g/L MnS04 · 4Η20、10· Og/L Ca3(P04)2、20. Og/L 琼脂组成的蒙金 娜无机磷固体培养基（pH7. 0?7. 5)上，再置于温度28°C的恒温培养箱中避光培养40h。
[0030] B、挑取在步骤A得到的直径最大的解磷圈单菌落，接入所述的NB液体培养基中， 然后置于恒温培养箱中，在温度28?30°C与转速180rpm的条件下培养24?48h，培养达 到对数期时，按照蒙金娜无机磷液体培养基体积计1 %的接种量，将其对数期培养物接种到 100ml 由 10. Og/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 3g/L NaCl、0. 3g/L KC1、 0.03g/L FeS04.7H20、0.03g/L MnS04.4H20、10.0g/L Ca3(P04)2 组成的灭菌蒙金娜无机磷液 体培养基（PH7. 0?7. 5)中，在温度28°C与180rpm的条件下振荡培养6d。然后，移取5ml 该振荡培养液，在转速12000rpm与温度4°C的条件下离心5min，分离得到的上清液采用常 规钥锑抗比色法测定解磷量。
[0031] 本发明人对步骤A得到的直径最大解磷圈单菌落菌体进行了如下分析验证，它具 有下述生物学特性：
[0032] 采用革兰氏染色、光学显微镜下观察菌体生物学特性：
[0033] 该菌体的形态特性是革兰氏阴性杆菌、无芽孢，参见附图2显微照片。
[0034] 该菌体的菌落形态特性为在NA培养基上培养至菌落2mm时菌落形态为：圆形、凸 起、表面光滑湿润、边缘整齐、菌落半透明并呈淡黄色，参见附图1。
[0035] 采用分子生物学鉴定（16s rDNA序列扩增及序列测定）方法，确定该菌株为荧光 假单胞菌P.florescens，命名为紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens)Fl。
[0036] 本发明的紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens)Fl具有下述性 质：
[0037] 该菌株具有解磷和生防的双重功效，紫外诱变后的菌株解磷能力显著提升。
[0038] 本发明紫外诱变型荧光假单胞菌F1保存方法：
[0039] 保藏培养基的成分为5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、18_20g/L琼脂与 1000ml 蒸馏水，pH 值 7. 0-7. 2。
[0040] 使用接种环蘸取紫外诱变型荧光假单胞菌F1于上述培养基的斜面或平板上划线 在温度28?30°C的条件下培养24?48h，后取出放于温度4°C的条件下保存。
[0041] 本发明还涉及所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1的培养方法。
[0042] 该培养方法的步骤如下：
[0043] A、斜面培养
[0044] 使用接种环将紫外诱变型荧光假单胞菌F1接种于试管斜面培养基中，然后置于 恒温培养箱中在温度28?30°C的条件下培养24?48h，得到一种斜面培养物；所述试管斜 面培养基的组成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、18?20g/L琼脂与1000ml 蒸馏水，pH值7.0?7. 2;
[0045] 本发明使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海实验仪器厂有限 公司生产的DHP120恒温培养箱。
[0046] B、液体培养
[0047] 将4?5环在步骤A得到的斜面培养物接种到NB液体种子培养基中，然后置于恒 温振荡培养箱中在温度28?30°C与转速180rpm的条件下振荡培养24?48h，得到一种含 有80?100亿/ml紫外诱变型荧光假单胞菌F1的发酵培养物；所述的NB液体种子培养基 组成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠与1000ml蒸馏水，pH7. 0?7. 2。
[0048] 本发明使用的恒温振荡培养箱是目前市场上销售的产品，例如由太仓市华美生化 仪器厂生产的QHZ-98A全温度振荡培养箱。
[0049] 本发明还涉及所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1在农业生产中的用途。
[0050] 在所述的农业生产用途中，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于溶解在土壤 中的不溶磷酸盐。
[0051] 人们知道，用于农作物的化学肥料主要是含氮、磷、钾的肥料，其中磷肥主要是磷 酸一铵、磷酸二铵、过磷酸钙等。目前，每年施入土壤中的磷肥只有5%?25%被植物吸 收，其余的磷肥被土壤固定，不能被植物吸收，由于多年来大量施入磷肥，因此，土壤积累了 大量的不能被植物利用的不溶磷酸盐，它们是磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙或氧基磷灰石 等。
[0052] 本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1能够溶解土壤中不溶磷酸盐的机制是：紫 外诱变型荧光假单胞菌F1能够产生乳酸、酒石酸等，降低PH，从而使难溶性的磷酸盐溶解。
[0053] 本发明紫外诱变型荧光假单胞菌F1的解磷能力测定步骤如下：
[0054] 将保藏于斜面培养基上的紫外诱变型荧光假单胞菌F1接种到常规的LB液体培养 基中，在温度30°C与转速180rpm的条件下培养至对数期，按照蒙金娜无机磷培养基体积的 1 %接种量，将培养对数期的紫外诱变型荧光假单胞菌F1培养物接种到100ml灭菌蒙金娜 无机磷培养基中，在温度28°C与转速180rpm的条件下振荡培养6h。将5ml振荡培养液在 转速12000rpm与温度4°C的条件下进行离心5min，移取0. lml上清液，并于刻度试管中定 容至5ml，将lml定容溶液加入10ml比色管中，加入2ml钥锑抗显色剂，再用水定容至刻度， 在温度高于25°C的地方放置30min，然后使用紫外可见分光光度计（尤尼科仪器有限公司） 在波长700nm处进行比色，测定吸光度；与此同时，以没有接种紫外诱变型荧光假单胞菌F1 的无机磷培养基作为空白对照进行分析。
[0055] 标准曲线的绘制：吸取磷标准溶液〔P (P) = 5mg/mL〕0、0· 50、1· 00、1· 50、2· 00、 2. 50、3. 00ml加到10ml比色管中，再加入2ml钥锑抗显色剂，加水定容至刻度，在温度高于 25°C的地方放置30min，然后使用同样的紫外可见分光光度计（尤尼科仪器有限公司）在波 长700nm处进行比色，测定吸光度，再以吸光度为横坐标，磷浓度为纵坐标绘制标准曲线， 其结果见附图3。
[0056] 根据标准曲线可以确定，没有接种紫外诱变型荧光假单胞菌F1的空白对照溶液 中的有效磷浓度为〇. 55mg/L，接种紫外诱变型荧光假单胞菌F1的溶液中有效磷浓度为 552. 8mg/L。由此可见，本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1具有非常强的解磷能力。
[0057] 具体地，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1按照lml/100g施用到土壤中，其解磷 能力达到 25?40mg/kg。
[0058] 在另一种用途中，所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于防治在土壤中的土传 病害。
[0059] 土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜 时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、细菌、放线菌、线虫等，其 中以真菌为主，通常分为非专性寄生与专性寄生。非专性寄生是外生的根侵染真菌，如腐霉 菌（Pythium spp.)引起苗腐和猝倒病、丝核菌引起苗立枯病。专性寄生是植物微管束病原 真菌，如尖孢镰（Fusarium oxysporum)、黄萎轮枝孢（Verticillium alboatum)等引起的萎 蔫、枯死。根病的严重程度受根端分泌物成分和浓度影响。因此，抑制根围系统病原物的活 动就成为保护根系并进行土传病害防治的基础。
[0060] 本发明所述的土传病害是小麦全蚀病、辣椒青枯病、姜瘟病、三七根腐病或茶叶炭 疽病。
[0061] 小麦全蚀病又称小麦立枯病、黑脚病。全蚀病是一种根部病害，只侵染麦根和莖基 部1-2节。苗期病株矮小，下部黄叶多，种子根和地中茎变成灰黑色，严重时造成麦苗连片 枯死。拔节期冬麦病苗返青迟缓、分蘖少，病株根部大部分变黑，有的时候在茎基部及叶鞘 内侧出现较明显灰黑色菌丝层。本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1防治小麦全蚀病的 作用机制是：采用紫外诱变型荧光假单胞菌F1拌种小麦后，荧光假单胞菌F1以大量菌体的 方式定植并在小麦种子周围繁殖，使得土传病害-小麦全蚀病病菌不能侵染小麦根系，从 而起到很好的预防作用。
[0062] 辣椒青枯病是植株细根首先褐变，不久开始腐烂并消失。切开接近地面部位的病 茎，可以发现维管束微有褐变，并从该部位分泌出白色混浊污汁。主要症状是植株迅速萎 蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。在高温高湿、重茬连作、地洼土黏、田间积水、土壤偏酸、偏施氮 肥等情况下，该病容易发生。本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1防治辣椒青枯病的作用 机制是土壤中施入紫外诱变型荧光假单胞菌F1后，荧光假单胞菌F1 -方面会迅速包围并 定植在辣椒根系，对辣椒根系起到强大的保护性屏障作用，使得辣椒青枯病病菌不能侵染 作物根系，从而起到很好的预防作用；另一方面，荧光假单胞菌F1分泌的嗜铁素会掠夺吸 收土壤中极为有限的Fe 3+，供自身吸收利用，导致病原真菌因缺乏铁元素而失去移动或侵染 能力；同时还会向土壤中分泌很多抗生素（例如2,4_二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、批 咯菌素、吩嗪-1-羧酸、假单胞菌酸、氰化氢等）具有广谱的抗细菌、抗真菌活性，表现在降 解病原真菌的细胞壁、抑制蛋白质合成等。
[0063] 姜癌病又称腐烂病或青枯病，主要危害根部及姜块，染病姜块初呈水渍状、黄褐 色、内部逐渐软化腐烂，挤压有白色汁液，味臭。茎部染病，呈暗紫色，内部组织变褐腐烂， 叶片凋萎，叶色淡黄，边缘卷曲，最后死亡。姜瘟病为细菌性病害，该菌在姜块内或土壤中越 冬，带菌姜种是主要的侵染源，栽种后成为中心病株，靠地面流水、地下害虫传播，病菌需借 助伤口侵入。本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1防治姜瘟病的作用机制与防治辣椒青 枯病相同。
[0064] 三七根腐病又称烂根病、鸡屎烂、臭七等。发病时，地上部叶色变黄，生长势差。初 期中午温度高时，叶稍下垂，早晚尚可恢复。挖出病株，根部染病变成黄褐色或腐烂。主、侧、 须根都能发病，以主根居多。并且以根茎部羊肠处开始腐烂的最为常见。后期病根全部成 为黑褐色或灰白色，稀泥浆状，故称"鸡屎烂"。本发明的紫外诱变型荧光假单胞菌F1防治 三七根腐病的作用机制与防治辣椒青枯病相同。
[0065] 使用本发明所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1发酵培养物时，按小麦种子拌种 试验方法，每亩地小麦种子用150ml荧光假单胞菌F1菌液拌种，充分搅拌均匀，阴凉处风干 后播种，对得到的试验结果进行统计分析得到，按照150ml/亩对小麦种子拌种，小麦全蚀 病的防治效果达到85?100%。
[0066] 使用本发明所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1发酵培养物时，辣椒青枯病防治 试验方法，分别于辣椒定植期、开花期、结果期分别冲施荧光假单胞菌F15L/亩/次，对得到 的试验结果进行统计分析得到，按照5L/亩/次，冲施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果达到 70 ?90%。
[0067] [有益效果]
[0068] 本发明的有益效果是：本发明提供了一株紫外诱变型荧光假单胞菌F1，该菌株不 仅能够将不溶性磷溶解为可溶性磷并提高磷肥利用率，并且对小麦全蚀病、辣椒青枯病等 土传病害具有显著的防效作用。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0069]图1是紫外诱变型荧光假单胞菌F1在蒙金娜固体培养基上解磷效果图，A为正面； B为反面；
[0070] 图2是紫外诱变型荧光假单胞菌F1的显微形态图；
[0071] 图3是磷标准曲线图；
[0072] 图4是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对小麦全蚀病病菌的拮抗作用图；
[0073] 图5是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对苹果腐烂病病菌的拮抗作用图；
[0074] 图6是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对草莓根腐病病菌的拮抗作用图；
[0075] 图7是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对马铃薯晚疫病病菌的拮抗作用图；
[0076] 图8是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对小麦全蚀病防效图；
[0077] 图9是紫外诱变型荧光假单胞菌F1对辣椒青枯病防效图。 【【具体实施方式】】
[0078] 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
[0079] 实施例1 :紫外诱变型荧光假单胞菌F1分离、纯化与鉴定
[0080] 该实施例的实施步骤如下
[0081] A、分离
[0082] 选用河南周口市有小麦全蚀病的哀退土壤地块，分别在该地块四周与中央在深度 10-20cm范围内各取100g 土壤，等量混匀。
[0083] 将10g 土样溶于90ml水中，在由太仓市华美生化仪器厂生产的QHZ-98A全温度 振荡培养箱中振荡培养20min，得到的上清液按照稀释度10'10'ΚΓ 5进行梯度稀释，将 100μ 1 稀释液涂布在由 10g/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 3g/L NaCl、 0· 3g/L KC1、0. 03g/L FeS04 · 7Η20、0· 03g/L MnS04 · 4Η20、10· Og/L Ca3(P04)2 与 20. Og/L 琼 脂组成的蒙金娜无机磷固体培养基（pH7. 0-7. 5)上，在温度28°C下倒置培养7-10天，然后 挑取最大溶磷圈的一株进行分离纯化，该分离菌株菌苔呈现半透明、淡黄色。
[0084] B、纯化
[0085] 将步骤A分离得到的菌落，放到1ml由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨与5g/L氯化钠 组成的NB培养基（pH7. 0-7. 2)中，振荡混合均匀，并将混匀的含有分离菌株的培养液涂布 在由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠与20g/L琼脂组成的NA培养基（pH7. 0-7. 2) 上，待单菌落长至2mm时，挑取半透明、淡黄色单菌落备用。
[0086] C、分离菌株鉴定
[0087] 采用革兰氏染色、光学显微镜下观察常规方法对分离菌株进行鉴定，其结果如 下：
[0088] 观察菌体形态特性：革兰氏阴性杆菌、无芽孢，如附图2的显微照片。
[0089] 观察菌落形态特性：在ΝΑ培养基上培养至菌落2mm时菌落形态为圆形、凸起、表面 光滑湿润、边缘整齐、菌落半透明并呈淡黄色。
[0090] 分子生物学鉴定（16srDNA序列扩增及序列测定）结果如下：
[0091] 样品总DNA的制备：按常规细菌DNA提取方法进行制备。
[0092] PCR引物：正向引物27F :AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ;反向引物 1492r :TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T
[0093] PCR反应体系：20μ 1反应体系，反应液组成：1μ 1 DNA模板、10μ 12XMastarMix、 0· 4μ 127F、0. 4μ 11492R，超纯水补足至 20μ 1。
[0094] PCR扩增程序：在温度94°C下2min ;30个循环（温度94°C时lmin，温度52°C时 lmin，温度 65°C时 8min);温度 65°C时 18min。
[0095] 扩增产物经0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测正确后测序，测序结果利用blast软件，进 行同源性比对，该菌株与荧光假单胞的同源性为99%，结合菌落特征、菌体形态特征及分子 生物学特性，从而鉴定该菌为荧光假单胞菌，并命名为紫外诱变型荧光假单胞菌F1。
[0096] 实施例2 :野生型荧光假单胞菌R)解磷能力的测定
[0097] 将保藏于斜面培养基上的野生型荧光假单胞菌R)接种到常规LB液体培养基中， 在温度30°C与转速180rpm的条件下培养至对数期，按照蒙金娜无机磷培养基体积的1% 的接种量，将野生型荧光假单胞菌接种到l〇〇ml灭菌的蒙金娜无机磷培养基中，在温度 28°C与转速180rpm的条件下振荡培养6h。取5ml振荡培养液在转速12000rpm与温度4°C 的条件下离心5min，取0. lml上清液并于刻度试管中定容至5ml，然后将lml定容溶液加 到10ml比色管中，再加入2ml钥锑抗显色剂，以水定容至刻度，在温度高于25°C地方放置 30min，接着使用紫外可见分光光度计（尤尼科仪器有限公司）在波长700nm处进行分光光 度比色，测定吸光度；同时以没有接种野生型荧光假单胞菌的无机磷培养基作为空白对 照液。
[0098] 标准曲线的绘制：吸取磷标准溶液〔P (P) = 5mg/mL〕0、0· 50、1· 00、1· 50、2· 00、 2. 50、3. 00ml加到10ml比色管中，再加入2ml钥锑抗显色剂，加水定容至刻度，在温度高于 25°C地方放置30min，然后使用同样分光光度计在波长700nm处进行分光光度比色，测定吸 光度，以吸光度为横坐标，磷浓度为纵坐标绘制标准曲线，参见附图3。
[0099] 测定结果：没有接种野生型荧光假单胞菌的空白对照溶液的有效磷浓度为 0. 55mg/L，接种野生型荧光假单胞菌R)的溶液的有效磷浓度为387. 89mg/L。由此可见，野 生型荧光假单胞菌具有强的解磷能力。
[0100] 实施例3 :野生型荧光假单胞菌的紫外诱变试验
[0101] A、挑取由小麦全蚀病的衰退土壤中分离得到的野生型荧光假单胞菌单菌落R)，接 入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠组成的NB培养基（pH7.0?7. 2)中，在温度 28?30°C与转速180rpm的条件下培养16?20h ;取2ml培养液放到直径75mm的无菌培养 皿中，然后置于功率20W的紫外灯下，在距离紫外灯30cm处照射90s，然后在黑暗中将该菌 液稀释至 10'接着涂布在由 10. 〇g/L葡萄糖、0. 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0. 3g/L NaCl、0.3g/L KCl、0.03g/L FeS04.7H20、0.03g/L MnS04.4H20、10.0g/L Ca3(P04)2 与 20.0g/ L琼脂组成的蒙金娜无机磷固体培养基（pH7. 0?7. 5)上，再置于上海实验仪器厂有限公司 生产的DHP120恒温培养箱中温度28°C下进行避光培养40h。
[0102] B、挑取在步骤A得到的最大直径2. 5mm的解磷圈单菌落（紫外诱变型荧光假单胞 菌F1)接入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠与1000ml蒸馏水组成的种子培养基 (pH7. 0?7. 2)中，然后置于上述恒温培养箱中在温度28?30°C与转速180rpm的条件下 培养24?48h，培养至对数期时，按照灭菌蒙金娜无机磷液体培养基的1 %的接种量，将所 述的培养液接种到l〇〇ml灭菌蒙金娜无机磷液体培养基中，在温度28°C与转速180rpm的条 件下振荡培养6d。让5ml振荡培养液在转速12000rpm与温度4°C的条件下进行离心5min， 移取0. lml上清液，于刻度试管中定容至5ml，将lml定容溶液加到10ml比色管中，再加入 2ml钥锑抗显色剂，以水定容至刻度，在温度高于25°C的地方放置30min，然后使用紫外可 见分光光度计（尤尼科仪器有限公司）在波长700nm处进行分光光度比色，测定吸光度。同 时，以没有接种荧光假单胞菌的无机磷培养基作为空白对照液。
[0103] 磷标准溶液的标准曲线绘制与实施例2的相同。
[0104] 测定结果：没有接种荧光假单胞菌的空白对照液的有效磷浓度为0. 55mg/L，接种 诱变型荧光假单胞菌F1溶液的有效磷浓度为552. 8mg/L，接种野生型菌株荧光假单胞菌R) 溶液的有效磷浓度为387. 89mg/L。由此可见，诱变型荧光假单胞菌F1的解磷能力比野生型 荧光假单胞菌F1的解磷能力提高40%。
[0105] 实施例4 :室内拮抗能力测定
[0106] 将紫外诱变型荧光假单胞菌F1接种到所述的NA培养基上在温度28°C下进行活 化培养24-48h ;分别让小麦全蚀病病菌、苹果腐烂病病菌与草莓根腐病病菌在PDA固体培 养基（200g/L去皮土豆在煮沸30min后用2层纱布过滤得到的滤液、20g/L蔗糖、20g/L琼 脂）上进行活化，马铃薯晚疫病病菌在面粉固体培养基（50g/L面粉、20g/L蔗糖、20g/L琼 脂）上活化，在温度28°C下培养6-7d，待病原真菌长满整个培养皿。
[0107] 拮抗效果测定：
[0108] 使用直径为9mm的打孔器分别打取紫外诱变型荧光假单胞菌F1和上述病原真菌 菌饼，挑取病原菌菌饼（小麦全蚀病病菌、苹果腐烂病病菌、草莓根腐病病菌）放入装有所 述PDA固体培养基的培养皿中央，马铃薯晚疫病病菌放在所述面粉固体培养基上，在左右 等距离处放入紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌饼，以没有接紫外诱变型荧光假单胞菌F1作 为对照，在温度28°C下培养6-7d，待对照长满整个培养皿后进行抑菌直径的测定，抑菌直 径测定方法如下：
[0109] 对照病原真菌直径为培养皿直径75mm，处理组直径为病原真菌的左右直径宽度；
[0110] 按照下述公式计算抑菌率：
[0111] 抑菌率（％ )=(对照组直径-处理组直径V (对照组-菌饼直径）X100%
[0112] 结果表明，紫外诱变型荧光假单胞菌F1对小麦全蚀病病原菌、苹果腐烂病病菌、 草莓根腐病病菌的抑制效果均非常明显，抑菌率分别达到82% (附图4)、84% (附图5)、 86% (附图6)，而对马铃薯晚疫病病菌的抑制效果更强，达到94% (附图7)。
[0113] 实施例5 :田间防病效果
[0114] 采用实施例1的方式制备紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌液，当菌数达到80-100 亿/ml时终止发酵备用，分别进行小麦全蚀病和辣椒青枯病的田间防治试验。对于小麦全 蚀病防治，选择在发生小麦全蚀病较为频繁的河南周口地区进行，按照150ml/亩的用量使 用紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌液拌种小麦种子，对照为不做任何处理，拌种的小麦种子 阴干后播种。在整个生长时期，观察小麦的长势情况及小麦全蚀病害发生情况。
[0115] 小麦苗期观察，使用紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌液拌种的小麦，长势更为健 壮，茎杆更为粗壮，且根系更为发达，根量多；小麦结穗期时，对照发生了较为严重的小麦全 蚀病，出现了白穗和"黑脚"的现象，而使用紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌液拌种的小麦几 乎未发生小麦全蚀病或是个别发生。分别调查300棵小麦中小麦全蚀病的发病情况，计算 平均防效。
[0116] 防效（％ )=(对照病情指数-处理组病情指数）/对照病情指数X 100%
[0117] 统计结果表明，对照小麦全蚀病的病情指数为100 %，而使用紫外诱变型荧光假单 胞菌F1菌液拌种的小麦全蚀病的病情指数为5%，防病效果达到95% (附图8)。
[0118] 对于辣椒青枯病防治，选择辣椒青枯病发病较为严重的山东青州的温室大棚内防 治，按照5-10L/亩/次用量，分别在定植期、苗期、坐果期冲施紫外诱变型荧光假单胞菌F1 菌液，对照组不做任何处理。在辣椒整个生长期内观察辣椒长势及辣椒青枯病的发病情况。 分别调查50棵辣椒中辣椒青枯病的发病情况，计算平均防效。
[0119] 统计结果表明，在第一穗果时期，对照发生了大面积辣椒青枯病，病情指数为 95%，而使用紫外诱变型荧光假单胞菌F1菌液冲施3次以上的辣椒发病较轻，病情指数为 26. 6%，防病效果达到72% (附图9)。
【权利要求】
1. 一株紫外诱变型突光假单胞菌（Pseudomonas florescens，P. florescens) F1，它已 于2014年2月17日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC NO. 8820。
2. 根据权利要求1所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1的培养方法，其特征在于该方法 的步骤如下： A、 斜面培养 使用接种环将紫外诱变型荧光假单胞菌F1接种于试管斜面培养基中，然后置于恒温 培养箱中在温度28?30°C的条件下培养24?48h，得到一种斜面培养物；所述试管斜面培 养基的组成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、18?20g/L琼脂与1000ml蒸馏 水，pH 值 7.0 ?7. 2; B、 液体培养 将4?5环在步骤A得到的斜面培养物接种到NB液体种子培养基中，然后置于恒温 振荡培养箱中在温度28?30°C与转速180rpm的条件下振荡培养24?48h，得到一种含有 80?100亿/ml紫外诱变型荧光假单胞菌F1的发酵培养物；所述的NB液体种子培养基组 成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨与5g/L氯化钠与1000ml蒸馏水，pH7. 0?7. 2。
3. 根据权利要求2所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1在农业生产中的用途。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于溶 解在土壤中的不溶磷酸盐。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述土壤的不溶磷酸盐是磷酸一钙、磷酸 二钙、磷酸三钙或氧基磷灰石。
6. 根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1按 照lml/100g施用到土壤中，其解磷能力达到25?40mg/kg。
7. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的紫外诱变型荧光假单胞菌F1用于防 治在土壤中的土传病害。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的土传病害是小麦全蚀病、辣椒青枯 病、姜瘟病、姜瘟病、三七根腐病或茶叶炭疽病。
9. 根据权利要求9述的用途，其特征在于使用权利要求2所述的紫外诱变型荧光假 单胞菌F1发酵培养物按照150ml/亩对小麦种子拌种，小麦全蚀病的防治效果达到85? 100%。
10. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于使用权利要求2所述的紫外诱变型荧光 假单胞菌F1发酵培养物按照5L/亩/次，冲施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果达到70? 90%。
【文档编号】C09K17/00GK104152380SQ201410386364
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月7日 优先权日:2014年8月7日
【发明者】杨娜, 李丽艳, 葛振宇, 朱瑞艳, 杜迎辉, 徐志文 申请人:领先生物农业股份有限公司