一种蓝色荧光量子点及其制备方法和铜离子检测应用与流程

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种蓝色荧光量子点及其制备方法和应用。

背景技术：

大自然中任何生命物质的生命活动都离不开水。但是，随着社会的高速发展，人类对水资源的依赖日渐增强，由工业废弃物不正当处理引起水污染的问题引起人们高度关注。由于重金属在生物体中极易富集并随生物链传递，从而对人类的生态环境和生命健康带来巨大的威胁。由于锡、铜、铅、锌、汞、铬等具有显著的生物毒性，且这些重金属通过微生物的作用可以转换为对生物毒性更大的物质。因此，它们已被列入控制污染物的黑名单。世界各国政府及联合国环境保护组织等出台了相关的规定，对饮用水和食品中的重金属含量进行严格地限制。我国对饮用水和食品中重金属含量也进行了明确的规定：生活饮用水中铬的最大限量为0.05mg·L-1，铝的最大限量为0.2mg·L-1，铜的最大限量为1mg·L-1。粮食中铜的极限含量为10mg·kg-1，铅的极限含量为0.2mg·kg-1，铬的极限含量为0.2mg·kg-1。禽畜肉类中铅的含量不得超过0.2mg·kg-1，铬的含量不得超过0.1mg·kg-1，铜的含量不得超过10mg·kg-1。同时，根据联合国卫生环保组织规定，饮用水中铜离子含量不得超过10μmol·L-1

铜是人类最早发现的金属，也是人类使用最广泛的金属，其广泛的应用于农业和工业产品中，如：试剂、农药、增塑剂、乳化剂和涂料等。同时，铜在调节生物体生理活动方面也具有重要的作用。一方面，适量的铜在生物体内对正常的生理活动起着无可替代的作用。在机体内，许多参与生理活动的酶都有铜的参与，比如抗坏血酸氧化酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等，其在生物转化中与电子传递氧化还原反应密不可分。同时，许多酶的代谢也与铜紧密相关。在生物体内，铜离子对铁元素的吸收、运输起着至关重要的作用。铜元素的缺乏会抑制生物体内血红蛋白的合成，造成血红蛋白含量降低，导致功能性贫血；同时，铜离子对内分泌系统和神经系统也有一定的影响。铜元素的缺乏对神经组织中铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶等的活性有着重要的影响，临床上所表现的症状主要有威尔森病(Wilson disease)、阿尔兹海默病(Alzheimer disease)、帕金森综合征(Parkinsonism)、中枢神经系统病(Central Nervous System Disease)等；同时，铜骨骼和软骨及其结缔组织的生理活动也有着至关重要的影响，铜元素缺乏会对儿童的骨骼生长产生影响。另一方面，机体内铜元素含量过高也会产生一定的危害。根据世界卫生组织研究显示，婴儿、儿童以及青少年每天铜的安全摄入量分别为80,40和30μg·kg-1。同时，根据中国营养学会(Chinese Nutrition Society)报告，成年人每天对铜的安全摄入量应为210～300mg；同样的，名美国国家食品营养委员会(National Nutritional Foods Association)推荐承认每天对铜的安全摄入量应为115～310mg。根据相关研究显示，机体内铜含量超过极限便会产生溶血。长期过量摄入铜会引发记忆力衰退、恶心、肝功能异常和肝脏肿大等。

铜离子传统检测方法有沉淀法、显色法、荧光探针法、金属量子点法等，但这些方法都存在灵敏度低和准确度不够等问题，很难检测到生物体中微量铜离子；同时荧光探针法和金属量子点法带来的生物毒性大大限制了其在线检测和应用。因此，开发高灵敏度和生物毒性低的铜离子检测方法实现微量铜离子的检测，可望实现因铜离子蓄积引起疾病的早期诊断。

近年来，随着纳米材料的发展，碳量子点作为一种新型的荧光纳米材料越来越受到研究者们的关注。目前，主要通过有机溶剂做钝化剂填补碳量子点表面的缺陷来提高荧光碳量子点的量子产率。然而，选择有机溶剂做钝化剂后续处理较为复杂。因此，广大研究者寻求更廉价更简单的方法来提高碳量子点荧光量子产率。由于N原子和C原子的半径相近，因此，在制备碳量子点的过程对其进行掺氮处理将会得到性能优异的氮掺杂碳量子点(N-CDs)。

目前，已报道的氮源主要有乙二胺、氨基酸、树状分子等。但是，这些含氮物质作为原料通过剧烈的反应将分子重新拆分后掺杂在碳量子点表面。由于碳量子点表面的氨基可以捕获铜离子形成铜氨络合物并覆盖在碳量子点表面而引起CDs荧光发生淬灭。然而，在制备碳量子点过程大多数氨基会被氧化、拆分或重组，导致所制备的碳量子点氨基数量降低以至于对铜离子检测的灵敏度降低。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种蓝色荧光量子点及其制备方法和应用，该制备方法路线设计合理，操作简单，重复性好，对设备要求低；制得的蓝色荧光量子点水溶性好，稳定性高，荧光性能优异，能够专一性的用于检测铜离子。

本发明是通过以下技术方案来实现：

1)以柠檬酸为碳源，以带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物为氮源，采用煎煮法制得碳量子点前驱体；

2)以乙二胺为修饰分子，丙烯酸甲酯为链接分子，对碳量子点前驱体进行修饰，制得蓝色荧光量子点。

优选地，步骤1)中采用煎煮法制备碳量子点前驱体，包括以下步骤：

1.1)按柠檬酸：带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物：水＝1g：0.5g：5mL的用量比，将柠檬酸与聚乙二胺树枝状聚合物分散于水中，在200℃煎煮处理2h，制得棕色溶液；

1.2)对棕色溶液离心处理，收集上清液，上清液依次经微孔滤膜过滤、透析及干燥处理，制得碳量子点前驱体。

进一步优选地，步骤1.2)中，上清液采用0.22μm注射器滤膜过滤，再将过滤后的溶液用10000Da的透析袋透析处理8h，制得平均粒径为4.4nm的碳量子点前驱体。

优选地，步骤2)中，以乙二胺为修饰分子，丙烯酸甲酯为链接分子，对碳量子点前驱体进行修饰，具体操作包括：

2.1)将碳量子点前驱体用甲醇萃取数次，收集甲醇萃取液，向甲醇萃取液中滴加丙烯酸甲酯，于30℃下反应24h，将反应后的溶液旋蒸除去甲醇，并用甲醇洗涤数次；

2.2)按甲醇：乙二胺＝10：16的体积比，向洗涤后的溶液中加入甲醇并逐滴滴加乙二胺，于30℃下反应24h；将反应后的溶液旋蒸除去甲醇，并用甲醇洗涤数次，制得黄色溶液；将所得的黄色溶液透析、冷冻干燥处理，制得蓝色荧光量子点。

优选地，所述带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物的具体制备方法如下：

步骤1：按4:10的体积比将乙二胺和甲醇充分搅拌均匀后，向该溶液中滴加丙烯酸甲酯，于30℃下反应24h；丙烯酸甲酯与乙二胺的体积比为1：4；

步骤2：将步骤1反应后的溶液旋蒸除去甲醇，再用甲醇洗涤数次，然后向洗涤后的溶液中加入甲醇并超声分散，再向分散后的溶液中滴加乙二胺，于30℃下反应24h；甲醇与乙二胺的体积比为10:(3～10)；

步骤3：将步骤2反应后的溶液旋蒸除去甲醇，再用甲醇洗涤数次，得到黄色油状液体为一代树状大分子1G-PAMAM；

步骤4：按4:10的体积比将一代树状大分子1G-PAMAM和甲醇充分搅拌均匀后，向该溶液中滴加丙烯酸甲酯，于35℃下反应36h；丙烯酸甲酯与一代树状大分子1G-PAMAM的质量比为1：4；

步骤5：将步骤4反应后的溶液旋蒸除去甲醇，再用甲醇洗涤数次，然后向洗涤后的溶液中加入甲醇并超声分散，再向分散后的溶液中滴加一代树状大分子1G-PAMAM，于35℃下反应48h；甲醇与一代树状大分子1G-PAMAM的体积比为20:(3～10)；

步骤6：将步骤5反应后的溶液旋蒸除去甲醇，再用甲醇洗涤数次，二代树状大分子2G-PAMAM；

一代树状大分子1G-PAMAM和二代树状大分子2G-PAMAM均为能够作为氮源的带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物。

本发明还公开了采用上述的方法制得的蓝色荧光量子点，该蓝色荧光量子点的平均粒径为25.3nm，表面电荷为+94.4mV。

本发明还公开了采用上述的蓝色荧光量子点作为铜离子检测荧光探针的应用。

优选地，所述蓝色荧光量子点对铜离子的检测浓度区间为0.01μmol·L^-1～600μmol·L^-1。

优选地，蓝色荧光量子点能够专一性检测细胞内的铜离子。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以柠檬酸为碳源，以经过修饰处理的聚乙二胺树枝状聚合物为氮源，通过煎煮法得到未经修饰的碳量子点前驱体(bare-CDs)。以乙二胺为修饰分子，丙烯酸甲酯为连接分子，通过酰胺反应将乙二胺修饰在碳量子点前驱体表面，形成氨基化碳点，制得蓝色荧光量子点NH2-CDs，该蓝色荧光量子点NH2-CDs在荧光仪或激光共聚焦仪下发射蓝色荧光，遇铜离子荧光淬灭。通过动态光散射粒度仪和透射电镜对其形貌和结构进行表征，通过红外光谱仪(FT-IR)对其表面官能团进行表征，所制备的bare-CDs和NH2-CDs的平均粒径分别为4.4nm和25.3nm，表面电荷分别为+40.1mV和+94.4mV，通过红外表征，NH2-CDs分别在1654cm^-1和1706cm^-1处出现酰胺键的特征峰，说明乙二胺成功的接枝在bare-CDs表面。

过羟基化、羧基化碳点及EDTA验证实验，说明促使NH2-CDs荧光发生淬灭的主要原因为其表面的氨基捕获溶液中的Cu²⁺并形成铜氨络合物导致的。采用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)和荧光分光光度计(PL)对其进行光学性能研究，PL和UV-vis图谱显示，Cu2+可使NH2-CDs荧光发生淬灭，对Cu²⁺的检测区间为0.01～600μmol·L^-1，检测极限为0.01μmol·L^-1。通过专一性实验，NH2-CDs可以作为专一性高效检测Cu²⁺的荧光探针。同时，以MCF-7、HepG-2和L-929细胞为模型探究NH2-CDs的细胞毒性，并采用激光共聚焦显微镜对细胞内荧光成像行为进行观察，实验结果显示，Cu²⁺的存在能明显淬灭NH2-CDs的荧光，在外加铜离子时，胞内荧光发生淬灭，淬灭时间为16s，说明NH2-CDs可实现对细胞中Cu²⁺的快速检测。

附图说明

图1为本发明的蓝色荧光量子点的制备及检测铜离子流程示意图；

图2A为碳量子点前驱体bare-CDs的透射电镜图和粒径分布图；

图2B为蓝色量子点NH2-CDs的透射电镜图和粒径分布图；

图2C为bare-CDs和NH2-CDs的表面电荷；

图2D为bare-CDs和NH2-CDs的红外谱图；

图3A为NH2-CDs荧光强度随浓度变化关系图；

图3B为NH2-CDs在不同波长激发下发射图谱；

图4为100μg·ml^-1NH2-CDs紫外可见吸收图谱、荧光激发和发射图谱；

图5为100μg·ml^-1NH2-CDs在不同浓度Cu²⁺中荧光谱图；

图6为100μg·ml^-1NH2-CDs在浓度为10μmol·L^-1不同金属离子(A)和氨基酸(B)溶液中的荧光强度；

图7为浓度为100μg·mL^-1的羟基化碳点(A)和羧基化碳点(B)在10μmol·mL^-1不同金属离子中荧光强度；

图8为NH2-CDs在缓冲液(A)及不同浓度NaCl溶液(B)中的荧光强度；

图9为(A)100μg·mL^-1的NH2-CDs在不同pH溶液中检测Cu²⁺荧光强度图；(B)NH2-CDs在浓度为0,400μmol·L^-1Cu²⁺及400μmol·L^-1Cu²⁺和400μmol·L^-1EDTA溶液中荧光强度图；

图10为不同浓度的NH2-CDs对HepG-2,MCF-7和L-929细胞毒性的影响；

图11为HepG-2和NH2-CDs共培养4h后与Cu²⁺在不同时间点下激光共聚焦图；

图12激光共聚焦下，100μg/ml NH2-CDs对MCF-7和HepG-2细胞中不同浓度铜离子(250nM、10μM和100μM)的荧光响应。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1碳量子点的制备

本发明所用的作为氮源的带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物可以选择市售的产品，也可以选择自行配制。

参见图1，本发明的蓝色荧光量子点NH2-CDs的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：G-PAMAM的制备

1)向圆底烧瓶中分别加入4mL乙二胺和10mL甲醇并搅拌5min。搅拌后向上述溶液中逐滴滴加16mL丙烯酸甲酯并在30℃下反应24h；

2)待反应结束后用旋转蒸发仪于30℃下除去甲醇，并用甲醇洗涤三次以除去大量的丙烯酸甲酯。向上述旋蒸后所得溶液中加入10mL甲醇并用超声将其分散均匀。再向分散后的溶液中逐滴滴加16mL乙二胺，并于30℃下继续反应24h；

3)反应结束后用旋转蒸发仪于30℃下除去甲醇，并用甲醇洗涤三次以除去大量的乙二胺，处理后得到黄色油状液体即一代树状大分子(1G-PAMAM)。

4)向圆底烧瓶中分别加入4mL一代树状大分子1G-PAMAM和10mL甲醇并搅拌5min，搅拌后向上述溶液中逐滴滴加16mL丙烯酸甲酯并在30℃下反应24h；

5)待反应结束后用旋转蒸发仪于30℃下除去甲醇，并用甲醇洗涤三次以除去大量的丙烯酸甲酯。向上述旋蒸后所得溶液中加入10mL甲醇并用超声将其分散均匀；

6)再向分散后的溶液中逐滴滴加16mL一代树状大分子1G-PAMAM，并于30℃下继续反应24h，反应结束后用旋转蒸发仪于30℃下除去甲醇，制得二代树状大分子2G-PAMAM，置于4℃冰箱保存。

一代树状大分子1G-PAMAM和二代树状大分子2G-PAMAM均可作为本发明的带有氨基的聚乙二胺树枝状聚合物，提供反应所需氮源。

步骤2：水热煎煮法制备碳点

准确称取1g柠檬酸，0.5g步骤1制备的2G-PAMAM于圆底烧瓶中并加入5mL纯净水超声将其分散。设置电加热套温度200℃对上述溶液加热2h得到棕色液体。将所得棕色溶液于高速离心机内10000rpm离心以去除加热过程中被碳化的物质。并将离心所得的上清液用0.22μm注射器滤膜过滤得到较小粒径的碳量子点前驱体(bare-CDs)。将过滤后的溶液置于分子量为1000Da透析袋中透析8h以除掉未反应的柠檬酸和2G-PAMAM。将纯化后的bare-CDs溶液冷冻干燥处理得到固体bare-CDs，并将其置于干燥器中。

步骤3：NH2-CDs的制备

将步骤2制备的bare-CDs用甲醇萃取三次并将萃取液转移至圆底烧瓶中。量取16mL丙烯酸甲酯并逐滴滴加至萃取液中于30℃下反应24h。待反应结束后，将反应后的溶液在30℃下旋蒸除去甲醇，并用甲醇洗涤三次以除去未反应的丙烯酸甲酯。向上述洗涤后的溶液中加入10mL甲醇并逐滴滴加16mL乙二胺于30℃下反应24h。反应完成后，30℃下旋蒸除去甲醇，并用甲醇洗涤三次以除去未反应的乙二胺。将所得的黄色溶液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中透析8h以除掉未反应的乙二胺和丙烯酸甲酯。将纯化后的NH2-CDs溶液冷冻干燥并将所得到的干燥固体置于干燥器中。

实施例2碳量子点的表征

1、平均粒径和Zeta电位表征

采用ZEN3600型马尔文动态光散射粒度仪测定bare-CDs和NH2-CDs两个样品的平均粒径和Zeta电位，测试介质为水，且测试温度为25℃。

2、TEM微观形貌与结构表征

取少量bare-CDs和NH2-CDs分别于5mL离心管内，向离心管内加入2mL无水甲醇并超声分散5min，将样品均匀滴在400目铜网上，采用Tecnai G2F20场发射透射电镜在80KV加速电压下观测样品形貌。采用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射粒度仪(DLS)和傅里叶红外光谱仪(FT-IR)对制备的bare-CDs和NH2-CDs样品进行了微观形貌观测。

由图2A所示，可以看出，采用水热煎煮法制备的bare-CDs具有规整的球形，颗粒之间单分散性良好，尺寸均一。通过马尔文动态光散射粒度仪对其进行扫描得到bare-CDs的平均粒径为4.4nm。以乙二胺为表面修饰剂，通过丙烯酸甲酯以酰胺键接枝在bare-CDs表面，使bare-CDs氨基化得到NH2-CDs。由图2B所示，NH2-CDs平均粒径增加至25.3nm。通过TEM图可以看出，NH2-CDs之间单分散性良好，尺寸均一，没有发生团聚现象。同时，由图2C可以看出，bare-CDs的Zeta电位为+40.1mV，NH2-CDs的Zeta电位为+94.4mV。这是由于2G-PAMAM作为氮源通过煎煮法构建碳点，2G-PAMAM上的氨基促使bare-CDs富含大量的氨基，从而使bare-CDs显正电荷。而乙二胺为修饰剂，通过丙烯酸甲酯接枝在bare-CDs表面使氨基的数量增加，因此NH2-CDs的Zeta电位较bare-CDs增加了54.3mV。

3、FT-IR表征

取bare-CDs和NH2-CDs冻干样品，溴化钾压片。采用Tensor 27型红外光谱仪测定红外吸收图谱，扫描范围为500～4000cm^-1。测试结果如图2D所示，由bare-CDs的红外图谱可以看出，3332cm^-1和1560cm^-1处分别为bare-CDs表面氨基N-H伸缩振动峰和弯曲振动峰，1148cm^-1处为C-N的弯曲振动峰，1328cm^-1处为-OH的弯曲振动峰，1483cm^-1处为羧基上-OH的弯曲振动峰。当乙二胺通过丙烯酸甲酯接以酰胺键接枝于bare-CDs表面后。在1654cm^-1处显现出酰胺键N-H的弯曲振动峰，1706cm^-1处显现出酰胺键的C-N弯曲振动峰。除此之外，3075cm^-1处为-NH2的伸缩振动峰，其峰变的更宽，说明通过乙二胺修饰后碳点的氨基化程度更高。而1560cm^-1处和1406cm^-1处分别为表面氨基的N-H弯曲振动峰和-OH的弯曲振动峰。

4、荧光性质

配制一定浓度的bare-CDs，NH2-CDs，2G-PAMAM溶液，采用荧光分光光度计测定其荧光图谱，扫描范围为200～700nm。结果如图3A所示，可以看出，NH2-CDs的荧光强度与其浓度成正相关关系。当NH2-CDs的浓度小于18μg·mL^-1时，NH2-CDs荧光强度随着其浓度增加而急剧增加。但是，当其浓度大于18μg·mL^-1时，随着NH2-CDs的浓度增加，其荧光强度增加变缓。由于在检测铜离子过程中，NH2-CDs的浓度对检测的灵敏性有显著性的影响。当NH2-CDs浓度较小时，由仪器信噪比引起的误差占主导因素。当NH2-CDs浓度较大时，虽然可以将仪器信噪比所带来的影响消除，但其较高的浓度则会降低检测的灵敏度。因此，根据反复实验确定NH2-CDs的检测浓度为100μg·mL^-1。

图3B为NH2-CDs在不同波长激发下其荧光发射图谱。由图可知，在不同波长激发下，NH2-CDs发射波长没有较大的改变。但是，其发射波长所对应的荧光强度随着激发波长先增加后减小。这是由于，乙二胺修饰后的NH2-CDs其粒径相对于bare-CDs增加至25nm。当碳量子点的粒径大于10nm后量子效应被削弱，其发射波长与激发波长不呈现依赖关系。因此，所合成的NH2-CDs具有较稳定的光谱学性质。

实施例3碳点检测铜离子

1、铜离子响应性实验

由于NH2-CDs表面的氨基可快速捕获溶液的Cu²⁺形成铜氨络合物并覆盖在其表面。根据荧光内率效应，所形成的铜氨络合物覆盖在NH2-CDs表面。此时，NH2-CDs表面所形成的铜氨络合物会阻止其接收外来紫外的刺激，或者当其接收到外来刺激后会阻止其荧光的发射。因此，当NH2-CDs捕获Cu²⁺后在其表面形成的铜氨络合物会改变其光谱行为。

结果参见图4，图4中a c e分别表示碳量子点NH2-CDs的紫外吸收光谱，激发光谱和发射光谱；b d f分别表示NH2-CDs与铜离子结合后的紫外吸收光谱，激发光谱和发射光谱；g和h分别表示在荧光灯下，碳量子点NH2-CDs与铜离子结合前后的荧光现象。由图4可知，NH2-CDs紫外特征吸收峰在232.2nm。当加入Cu²⁺后，NH2-CDs紫外特征峰蓝移至206.4nm。同时，在365nm处出现一个新峰。这是由于氨基与Cu²⁺形成铜氨络合物导致的。由NH2-CDs的激发和发射图谱可以看出。在不含铜离子时，NH2-CDs的激发和发射波长分别为349nm和454nm，对应的强度分别为563.6和444.2；加入铜离子后NH2-CDs的激发和发射波长不变，对应的强度依次降低至100.1和85.4。由于Cu²⁺与NH2-CDs表面-NH2络合形成铜氨络合物覆盖在NH2-CDs表面。根据荧光内滤效应，所形成的络合物覆盖在NH2-CDs表面将阻止NH2-CDs接受紫外激发和阻止碳点发射光谱，从而导致NH2-CDs在捕获Cu²⁺后其激发和发射强度在一定程度上均被削弱。可以看出，所制备的NH2-CDs在紫外365nm激发下显示蓝光，当加入Cu²⁺后，在365nm激发下荧光强度明显降低。

2、Cu²⁺线性关系检测

准确称取上述方法制备的NH2-CDs并将其溶于PBS(pH＝7.4)缓冲液中，并采用逐级稀释法得到浓度为100μg·mL^-1的NH2-CDs母液；采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲溶液为溶剂依次配制浓度为1μmol·L^-1，1mmol·L^-1的Cu²⁺母液。

以上述所配Cu²⁺液体为母液，PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂分别配制浓度为0，0.01,0.05,0.25,0.5,0.75,10,50,100,250,400,600μmol·L^-1的Cu²⁺待检测液。向上述待测中加入ⅰ所配制的NH2-CDs母液，使待测液中NH2-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。

结果如图5所示，在激发和发射通道都为5nm条件下，100μg·mL^-1NH2-CDs荧光强度为468.9。当溶液中铜离子浓度不断增加，NH2-CDs的荧光强度也随之减弱，当Cu²⁺浓度增加至600μmol·mL^-1时其荧光强度降低至81.9，其荧光强度是不含铜离子的0.17倍。通过拟合曲线可以看出NH2-CDs检测铜离子的区间为0.01～600μmol·L^-1，其拟合方程为Y＝3.4281+0.34718X，R²＝0.94289，具有较宽的检测范围。通过拟合曲线可以看出该探针在浓度为100μg·mL^-1下检测铜离子的极限为0.01μmol·L^-1。

3、NH2-CDs选择性检测

1)金属杂离子干扰实验

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的杂离子母液(M⁺:Co²⁺,Mn²⁺,Ag⁺,Cs²⁺,Zn²⁺,Hg²⁺,Na⁺,Fe²⁺,K⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Ni²⁺,Ca²⁺,Fe³⁺)。将所配得的杂离子母液进行稀释配得浓度为10μmol·L^-1的杂离子待测液。向上述待测液中加入上述方法配制的NH2-CDs母液，使待测液中NH2-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。

2)氨基酸干扰实验

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的氨基酸母液(L-Pro,L-ALa,L-Lys,L-Met,L-Ser,L-GLy,L-GLu,L-Leu,L-Hyp,L-His,L-Cys)。将所配得的氨基酸母液进行稀释配得浓度为10μmol·L^-1的氨基酸待测液。向上述待测液中加入上述方法配制的NH2-CDs母液，使待测液中NH2-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。

为了检测所制备的NH2-CDs仅能被Cu²⁺淬灭，我们选择了不同种类的金属离子和氨基酸对其进行验证。如图6中(A)所示，为100μg·mL^-1NH2-CDs在不同金属离子溶液中，在365nm紫外激发下的荧光强度。所检测的15种金属离子唯独Cu²⁺离子能使NH2-CDs荧光发生淬灭。尤其在元素周期表中与Cu²⁺相邻的Ni²⁺和Zn²⁺离子均不能使其荧光发生淬灭。说明所合成的NH2-CDs具有很好的专一性，可以专一性的检测溶液中的Cu²⁺。图6(B)为100μg·mL^-1NH2-CDs在不同氨基酸溶液中的荧光强度图，可以看出氨基酸的加入对NH2-CDs的荧光强度均无影响。从侧面证明所制备的NH2-CDs可应用于生物体内Cu²⁺检测。

3)稳定性实验

采用逐级稀释法以蒸馏水为溶剂分别配置NH2-CDs浓度为10μg·mL^-1且NaCl的浓度分别为0.1,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2mol·L^-1，并将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。

采用逐级稀释法以蒸馏水为溶剂分别配置浓度为1μmol·L^-1的PBS(pH＝7.4)、Tris-HCl、Tris-HAc、Tris-NaAc、CA-SC、Tris-EDTA和HePes-Tris缓冲液，并以此缓冲液为母液，分别配置NH2-CDs浓度为10μg·mL^-1且各缓冲液浓度分别为100nmol·L^-1的含NH2-CDs的缓冲液，并将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。

为了验证NH2-CDs荧光淬灭是由其表面的氨基捕获Cu²⁺在表面形成一层络合物引起的。采用羟基化和羧基化碳点对金属杂离子进行检测。结果如图7所示，可以看出，在相同通道宽度下，羟基化和羧基化CDs的荧光强度分别为412和550。与所制备的NH2-CDs略有差异，其原因主要在于CDs表面的官能团为CDs荧光团电子的给予体，在紫外激发下其表面官能团将电子转移至荧光发光团。因此，CDs表面官能团不同可导致CDs产生不同的荧光强度。另一方面，Cu²⁺并不能改变两个CDs的荧光强度，这是由于羟基和羧基无法捕获溶液中自由的Cu²⁺，从而无法在CDs表面形成一层络合物导致CDs依旧能接受外界紫外的刺激而发出荧光。由于所制备的CDs的碳源均选取柠檬酸，在碳源相同的情况下排除了柠檬酸作为碳源对实验结果带来的误差，此实验结果充分说明了加入Cu²⁺后致使NH2-CDs荧光发生淬灭的主要原因为其表面的氨基捕获溶液中的Cu²⁺并在其表面生成一层络合物致使其荧光发生淬灭。

为了进一步探究所制备的NH2-CDs的光学稳定性。本实验通过设计不同种类的缓冲液及不同浓度的NaCl溶液对探针光学稳定性进行探究。结果如图8所示，图8中(A)为探针在PBS,Tris-HCl,Tris-HAc,Tris-NaAC,CA-SC,Tris-EDTA,HePes-Tris缓冲液中的荧光强度图，从图中可以看出探针在7种缓冲液中荧光强度偏差不大，说明所制备的NH2-CDs应用范围广，可应用于多种缓冲液的铜离子检测当中去。图8中(B)为探针在不同浓度NaCl溶液中的荧光强度，可以看出，在浓度为0.1～2mol·L^-1的NaCl溶液中NH2-CDs的荧光强度变化不大，尤其在0.1mol·L^-1NaCl溶液中荧光强度与在PBS缓冲液中的荧光强度相等。说明本发明所制备的NH2-CDs可应用于生理盐水中Cu²⁺的检测。

4、NH2-CDs检测机理研究

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的乙二胺四乙酸(EDTA)母液。依次加入200μL浓度为1mmol·L^-1的Cu²⁺母液、200μL EDTA母液、50μL上述方法所配的NH2-CDs母液及50μL超纯水。将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测NH2-CDs的荧光强度。结果如图9所示，图9中(A)为在不同pH条件下NH2-CDs对Cu²⁺检测的荧光强度分布图。由图可知，在不加Cu²⁺时NH2-CDs在不同pH环境中荧光强度不同。在pH＜7时，其荧光强度随着pH的降低而降低。在pH＞7时，其荧光强度不发生较大的波动。主要由于所制备的NH2-CDs表面含有大量的氨基，在酸性环境中，氨基被质子化从而阻碍了电子的跃迁。在中性及碱性溶液中，NH2-CDs表面的-NH2未被质子化，-NH2作为电子给予体可在紫外的激发下向荧光团提供电子。同时，当pH介于6～8时，NH2-CDs对铜离子响应较为灵敏。当pH＜6和pH＞8时，NH2-CDs对Cu²⁺的响应度急剧下降。这是因为在酸性体系环境中，NH2-CDs表面的氨基被质子化阻碍了氨基捕获Cu²⁺，从而无法使其荧光淬灭；在碱性环境中，虽然氨基裸露在NH2-CDs表面，但是Cu²⁺与溶液中的氢氧根结合生成Cu(OH)2沉淀，进而使NH2-CDs无法对碱溶液中的Cu²⁺进行检测。由于所制备的NH2-CDs的检测pH区间为6～8。因此，所制备的探针可应用于生物体内正常细胞及组织Cu²⁺的检测。

图9中(B)为EDTA荧光复原检测。可以看出，在已发生荧光淬灭的溶液中加入与Cu²⁺等浓度的EDTA试剂，NH2-CDs的荧光强度发生了复原。在已淬灭的NH2-CDs中加入EDTA，由于EDTA与Cu²⁺具有更强效的络合能力，可以将NH2-CDs表面被-NH2捕获的Cu²⁺捕获出来，从而破坏了NH2-CDs表面的络合物层，使NH2-CDs荧光复原。该结果说明所制备的探针可以重复使用去检测Cu²⁺。

5、细胞实验

1)细胞毒性实验

选用L-929为正常细胞模型，HepG-2和MCF-7为肿瘤细胞模型对NH2-CDs细胞毒性进行探究。无菌操作条件下，采用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，2000rpm离心5min收集细胞。采用新鲜DMEM培养液悬浮细胞并计数，配制细胞悬液使细胞浓度为5×10³个·mL^-1。并将5000个细胞种入96孔板中，每孔加入100μL培养基于37℃下培养箱培养24h。分别配制浓度为0,2,4,8,10,20,40,60,80,100μg·mL^-1的NH2-CDs培养基溶液，且每个浓度设计5个复孔。所有孔板均设置空白孔，即孔内只含培养基。用含有药物的溶液更换96孔板中原有培养基，培养24h。随后用浓度为5mg·mL^-1的MTT溶液更换96孔板中的溶液培养4h，移除原培养基，吸取100μL DMSO注入各孔溶解甲瓒，采用酶标仪于490nm处测定吸光度。

细胞存活率＝(ODtreated/ODcontrol)×100％

其中，ODcontrol是不含药物载体孔的吸光度，ODtreated是含有药物载体孔的吸光度。

图10分别为NH2-CDs对HepG-2，MCF-7和L-929细胞的细胞毒性图。从三个细胞的细胞毒性图中可以看出，在所测试的2μg·mL^-1～100μg·mL^-1浓度范围内，三株细胞存活率均保持在95％以上，说明在NH2-CDs检测浓度范围内对三株细胞无毒性作用，具有较好的生物相容性。

2)细胞成像实验

选用MCF-7和HepG-2为细胞模型进行细胞摄取行为及细胞内铜离子检测研究。首先配制含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(青霉素/链霉素)的培养基。将4×10⁵个细胞分散于8mL培养基中并分别加入4个激光共聚焦皿中，于培养箱37℃下培养24h。在倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞状态良好时向4个激光共聚焦皿内分别加入2mL NH2-CDs浓度为10μg·mL^-1的培养基溶液，培养4h后弃掉材料液，用PBS溶液洗涤2～3次后，向其中三个激光共聚焦皿内加入含有不同浓度铜离子的培养基溶液。浸泡5min后将含有铜离子的培养基弃掉，并用PBS溶液洗涤2～3次后，将细胞浸泡于PBS溶液中于激光共聚焦观察细胞内荧光情况。

为了探究NH2-CDs荧光探针在胞内检测铜离子荧光动态淬灭过程。我们将NH2-CDs与HepG-2和MCF-7细胞共培养4h后将一定浓度的铜离子加入培养皿中在激光共聚焦显微镜下进行扫描。如图11所示，为对HepG-2细胞23s的动态扫描，在激光共聚焦下，碳量子点NH2-CDs与铜离子结合过程，随着结合时间延长，荧光逐渐淬灭。可以看出，在0s即铜离子加入的瞬间，细胞内依然呈现出清晰的蓝色荧光。当达到6s后细胞内蓝色荧光逐渐减弱，直到20s细胞内蓝色荧光被淬灭达到稳定。这一现象说明，所制备的NH2-CDs可应用于细胞内铜离子快速实时监测。无法通过细胞核核膜进入细胞核内。

为了评价所制备的NH2-CDs在生物系中荧光检测的应用前景，图12为采用所制备的NH2-CDs直接用于HepG-2和MCF-7细胞中Cu²⁺的荧光检测。激光共聚焦下，100μg/ml NH2-CDs对MCF-7和HepG-2细胞中不同浓度铜离子(250nM、10μM和100μM)的荧光响应。从图中可以观察到，用NH2-CDs孵育过的HepG-2和MCF-7细胞呈现出清晰的蓝色荧光；当加入不同浓度的铜离子后，Cu²⁺自由扩散进入细胞内并被胞内NH2-CDs捕获致使胞内荧光淬灭。由于细胞膜内外荧光探针存在渗透压，且NH2-CDs荧光探针的生物毒性低，只有细胞对它摄取量足够，才能够准确实现对细胞内对Cu²⁺的灵敏检测的荧光成像。