氧杂蒽类荧光探针及其在硫氧化物检测中的应用的制作方法

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种氧杂蒽类荧光探针及其在硫氧化物检测中的应用。

背景技术：

硫氧化物sox(x=2，3)是硫的氧化物的总称，主要包含二氧化硫以及三氧化硫。二氧化硫是煤炭燃烧过程中产生的大气污染物，易溶于水，一定条件下被氧化形成三氧化硫。随着经济的飞速发展、工业化城市化建设的快速推进、化石能源的超常规使用，目前生态环境严重破坏，环境质量急剧下降。硫氧化物是大气中含量较高的一类易于输运、迁移与转化的环境污染物，同时也是环境酸化的主要原因，大气污染物中硫氧化物的排放量远高于烟尘、氮氧化物以及二氧化碳等其他物质，二氧化硫已被作为衡量大气污染程度的重要指标。故对空气中硫氧化物进行检测并采取有效的治理措施，对改善人类居住环境具有重要意义。因此，建立一种快速、简便、准确、灵敏的检测大气中气态sox(x=2，3)含量的方法迫在眉睫。

目前用于检测sox(x=2，3)的方法有定电位电解法法、高效液相色谱法、离子色谱法、原子吸收光谱法、电导法、氧化还原法、电化学法、化学发光法、紫外荧光法等。尽管这些方法测定灵敏度较高，但操作繁琐、样品处理复杂、选择性低、成本高、费时，无法实现硫氧化物的实时以及现场检测。相比较而言，荧光探针法由于操作简单、选择性高、检测成本低、易于实现可视化以及实时监控，具有绝对优势，目前研究人员已经致力于硫氧化物荧光传感器的开发与设计。但目前用于检测硫氧化物的荧光传感器大多基于荧光猝灭机理进行设计，其灵敏度低于荧光增强型的荧光探针；尚未见对so2、so3具有双重响应的荧光传感器的报道，故开发用于同时检测硫氧化物的荧光增强型传感器仍是一个挑战。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种基于电子转移作用的“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针，并将其用于硫氧化物的检测。该类荧光探针对硫氧化物具有响应快速、选择性高、专属性好等优点，可在常温常压条件下进行检测，在环境工程、污染气体检测等方面具有很好的应用前景。

一种氧杂蒽类荧光探针，其结构式如式i所示：

，

其中，r1、r2、r3、r4为-h、-ch3或-ch2ch3，r5为o、n-nh2或。

进一步地，所述氧杂蒽类荧光探针的结构式如式ⅱ所示：

。

进一步地，所述氧杂蒽类荧光探针的结构式如式ⅲ所示：

。

进一步地，所述氧杂蒽类荧光探针的结构式如ⅳ所示：

。

上述氧杂蒽类荧光探针在硫氧化物检测中的应用。

氧杂蒽类罗丹明染料及其衍生物具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、激发以及发射波长长、光稳定性好、背景干扰小等优点，常被用作性能优良的荧光载体。罗丹明类荧光探针通常含有螺内酰胺或螺内酯结构，保持闭环状态，溶液为无色且无荧光，而一旦螺环结构打开，溶液则呈现红色，荧光强度明显增加，故本发明将罗丹明类荧光探针内酰胺或酯基作为识别基团用于检测待分析物，利用其结构内特殊的螺环结构与分析物发生电子转移作用后开环，导致其颜色与荧光产生明显增强型（turn-on）的响应，设计了一类“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针，并将此类荧光探针用于硫氧化物快速、灵敏的检测。

本发明所提供的基于电子转移机制的“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针，利用其结构中叔氮具有未共享的孤对电子，作为路易斯碱，可与sox(x=2，3)（作为路易斯酸）发生相互作用，诱导分子内电荷转移，导致螺内酰胺开环，使探针分子荧光显著增强，如图1所示。本发明将此“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针用于sox(x=2，3)的检测。该类探针可在氯仿中实现对sox(x=2，3)的检测，当有sox(x=2，3)存在时，该类探针溶液颜色由无色变为粉红色，探针荧光增强程度与sox(x=2，3)浓度在一定范围内线性相关，空气及o2、co2、n2、h2s、nh3均无干扰，具有响应快速、选择性高、专属性好、简便快速等优点，有望用于大气中硫氧化物快速准确的时空分辨监测。

附图说明

图1为本发明的罗丹明类荧光探针检测sox(x=2，3)的构型变化示意图。

图2（a）为荧光探针rs1（1μmol/l）在不同浓度so2（0~13.5μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图2（b）为荧光探针rs1（1μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so2（0~13.5μmol/l）的荧光响应曲线。

图2（c）为荧光探针rs1（10μmol/l）加入不同浓度so2（0~225.0μmol/l）的紫外可见光谱图。

图3（a）为荧光探针rs1（1μmol/l）在不同浓度so3（0~13.5μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图3（b）为荧光探针rs1（1μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so3（0~13.5μmol/l）的荧光响应曲线。

图3（c）为荧光探针rs1（10μmol/l）加入不同浓度so3（0~125.0μmol/l）的紫外可见光谱图。

图4（a）为荧光探针rs2（25μmol/l）在不同浓度so2（0~585.0μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图4（b）为荧光探针rs2（25μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so2（0~585.0μmol/l）的荧光响应曲线。

图4（c）为荧光探针rs2（50μmol/l）加入不同浓度so2（0~1925.2μmol/l）的紫外可见光谱图。

图5（a）为荧光探针rs2（25μmol/l）在不同浓度so3（0~725.0μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图5（b）为荧光探针rs2（25μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so3（0~725.0μmol/l）的荧光响应曲线。

图5（c）为荧光探针rs2（50μmol/l）加入不同浓度so3（0~1750.0μmol/l）的紫外可见光谱图。

图6（a）为荧光探针rs3（25μmol/l）在不同浓度so2（0~40.5μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图6（b）为荧光探针rs3（25μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so2（0~40.5μmol/l）的荧光响应曲线。

图6（c）为荧光探针rs3（50μmol/l）加入不同浓度so2（0~112.5μmol/l）的紫外可见光谱图。

图7（a）为荧光探针rs3（25μmol/l）在不同浓度so3（0~95.0μmol/l）存在时荧光光谱变化图。

图7（b）为荧光探针rs3（25μmol/l）在586nm处的荧光强度对不同浓度so3（0~95.0μmol/l）的荧光响应曲线。

图7（c）为荧光探针rs3（50μmol/l）加入不同浓度so3（0~212.5μmol/l）的紫外可见光谱图。

图8为荧光探针rs1（1μmol/l）在充入o2、co2、h2s、n2、nh3、so2、so3时586nm处的荧光强度变化。

图9为荧光探针rs2（25μmol/l）在充入o2、co2、h2s、n2、nh3、so2、so3时586nm处的荧光强度变化。

图10为荧光探针rs3（25μmol/l）在充入o2、co2、h2s、n2、nh3、so2、so3时586nm处的荧光强度变化。

具体实施方式

为了进一步对本发明进行说明，下面结合具体实施例对本发明提供的基于电子转移机制的“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针及其制备方法，及其在sox(x=2，3)检测中的应用进行详细阐述。

仪器与试剂：

以下所有荧光测试在hitachif-4600荧光分光光度计上进行；紫外可见光谱测试在shimadzuuv-1700紫外可见分光光度计上进行。

罗丹明b（95.0%）、水合肼（99.0%）、乙二醛（40.0%）从阿拉丁试剂有限公司购得。

三氧化硫吡啶络合物（98%）从九鼎化学试剂有限公司购得。

氯仿为分析纯，无需进一步纯化与处理；实验过程中所用的水均为去离子水。

实施例1

荧光探针rs1（式ⅱ所示）的合成：称取罗丹明b（143.0mg）与naoh（12.0mg）加入干燥圆底烧瓶中，并加入25.00ml去离子水溶解，室温下磁力搅拌同时缓慢加入25.00ml环己烷，室温搅拌2h后停止反应，收集环己烷层液体，减压蒸馏除去溶剂，真空干燥，并用cacl2除水，得到罗丹明内酯rs1粉红色固体粉末，分子式：c28h30n2o3，产率为70%。（chemicalphysicsletters,1976,43(1),141-145）

扫描荧光光谱时，采集1μmol/lrs1探针与0~13.5μmol/l的so2或so3反应后的荧光光谱。固定激发波长为490nm，入射以及出射狭缝为5nm，记录530~750nm范围内荧光强度变化，并作出586nm处的荧光强度随so2、so3浓度变化曲线及相应线性关系曲线，结果见图2（a）、2（b）、3（a）、3（b）。

扫描紫外光谱时，采集10μmol/lrs1探针与0~225.0μmol/l的so2以及0~125.0μmol/l的so3反应后的紫外光谱，记录235nm~615nm范围内的紫外光谱变化。结果见图2（c）、3（c）。

结果显示，随着sox(x=2，3)浓度增大，荧光探针rs1溶液由无色变为红色，荧光强度明显增加，由荧光光谱分析，sox(x=2，3)浓度4.0~9.0μmol/l范围内获得线性响应，其中so2线性方程为f/f0-1=11.86[so2]-38.20（r²=0.992），检出限为0.276μmol/l，so3线性方程为f/f0-1=25.357[so3]-77.081（r²=0.994），检出限为0.129μmol/l，其中f0代表未加入sox(x=2，3)荧光探针rs1溶液的在586nm处测得的起始荧光强度，f代表加入sox(x=2，3)后荧光探针rs1溶液在586nm处测得的荧光强度，[sox]代表加入的sox(x=2，3)的浓度。

实施例2

荧光探针rs2（式ⅲ所示）的合成：称取罗丹明b（1.2g）加入干燥圆底烧瓶中，并加入30.00ml无水甲醇溶解，室温下磁力搅拌同时缓慢加入过量的水合肼4.00ml，氮气保护下水浴加热至75℃，回流搅拌反应4h至溶液褪色。将反应混合物冷却至室温后，倒入去离子水中，用乙酸乙酯-水（1:1）萃取三次以上，直至水层无色，混合乙酸乙酯层，减压蒸馏除去溶剂，真空干燥得到罗丹明b酰肼rs2粉红色固体粉末，分子式：c28h32n4o2，产率66.6%。（analyticachimicaacta,2002,456,121-128）

扫描荧光光谱时，采集25μmol/lrs2探针与0~585.0μmol/l的so2或0~725.0μmol/lso3反应后的荧光光谱。固定激发波长为520nm，入射以及出射狭缝为5nm，记录530~750nm范围内荧光强度变化，并作出586nm处探针的荧光强度随so2、so3浓度变化曲线及相应线性关系曲线，结果见图4（a）、4（b）、5（a）、5（b）。

扫描紫外光谱时，采集50μmol/lrs2探针与0~1925.2μmol/l的so2以及0~1750.0μmol/l的so3反应后的紫外光谱，记录225~600nm范围内的紫外光谱变化。结果见图4（c）、5（c）。

结果显示，随着sox(x=2，3)浓度增大，荧光探针rs2溶液由无色变为红色，荧光强度明显增加。由荧光光谱分析，so2浓度在247.5~450.0μmol/l范围内获得线性响应，线性方程为f/f0-1=0.838[so2]-132.77（r²=0.991），检出限为73.17μmol/l；so3浓度在125.0~625.0μmol/l范围内获得线性响应，so3线性方程为f/f0-1=0.548[so2]-26.383（r²=0.994），检出限为33.52μmol/l，其中f0代表未加入sox(x=2，3)荧光探针rs2溶液的在586nm处测得的起始荧光强度，f代表加入sox(x=2，3)后荧光探针rs2溶液在586nm处测得的荧光强度，[sox]代表加入的sox(x=2，3)的浓度。

实施例3

荧光探针rs3（式ⅳ所示）的合成：称取实施例2中rs2（0.4g）加入干燥的圆底烧瓶中，并加入15.00ml无水乙醇溶解，室温下磁力搅拌同时加入过量的乙二醛（40%，2.00ml）后，搅拌反应8h后停止反应。将反应混合物倒入饱和食盐水中析出沉淀，抽滤，用水洗涤2次，真空干燥得粗产物，以石油醚/乙酸乙酯（6:1，v/v）为洗脱剂经柱层析纯化，收集下层黄色液体，减压蒸馏除去溶剂，真空干燥得到罗丹明醛基化合物rs3橙黄色固体，分子式：c30h32n4o3，产率76.8%。（sensorsandactuatorsb,2011,1(152),8-13）

荧光探针储备液的配置：一定量的荧光探针用氯仿完全溶解，配置成1mmol/l荧光探针储备液。

so2储备液制备：so2气体由适量na2so3在h2so4在50ml圆底烧瓶中反应制得，将其充入10ml氯仿中溶解，so2准确浓度根据beer-lambert定律，通过测定其在波长为278nm处的紫外吸收值计算得出，so2储备液浓度为1mmol/l。

so3储备液制备：一定量的三氧化硫吡啶络合物用乙醇完全溶解，配置成1mmol/lso3储备液。

进行荧光以及紫外测试前，量取一定体积荧光探针储备液以及不同体积的sox储备液，使用氯仿稀释至所需浓度后进行测试。

扫描荧光光谱时，采集25μmol/lrs3探针与0~40.5μmol/l的so2或0~95.0μmol/lso3反应后的荧光光谱。固定激发波长为520nm，入射以及出射狭缝为5nm，记录530~750nm范围内荧光强度变化，并作出586nm处探针的荧光强度随so2、so3浓度变化曲线及相应线性关系曲线，结果见图6（a）、6（b）、7（a）、7（b）。

扫描紫外光谱时，采集50μmol/lrs3探针与0~112.5μmol/l的so2以及0~212.5μmol/l的so3反应后的紫外光谱，记录225nm~600nm范围内的紫外光谱变化。结果见图6（c）、7（c）。

结果显示，随着sox(x=2，3)浓度增大，荧光探针rs3溶液由无色变为红色，荧光强度明显增加。由荧光光谱分析，so2浓度在5.625~24.750μmol/l范围内获得线性响应，线性方程为f/f0-1=7.878[so2]-17.462（r²=0.998），检出限为0.225μmol/l；so3浓度在5.0~40.0μmol/l范围内获得线性响应，so3线性方程为f/f0-1=6.299[so2]-21.159（r²=0.996），检出限为0.114μmol/l，其中f0代表未加入sox(x=2，3)荧光探针rs3溶液的在586nm处测得的起始荧光强度，f代表加入sox(x=2，3)后荧光探针rs3溶液在586nm处测得的荧光强度，[sox]代表加入的sox(x=2，3)的浓度。

实施例4

荧光探针rs1、rs2、rs3对sox选择性与抗干扰能力

在1μmol/l荧光探针rs1溶液、25μmol/l荧光探针rs2溶液、25μmol/l荧光探针rs3溶液中分别充入o2、co2、h2s、n2、nh3、so2、so3，测试rs1、rs2、rs3荧光探针在586nm处的荧光强度变化。

在1μmol/l荧光探针rs1溶液、25μmol/l荧光探针rs2溶液、25μmol/l荧光探针rs3溶液中分别充入o2、co2、h2s、n2、nh3后，再加入so2、so3，测试rs1、rs2、rs3荧光探针在586nm处的荧光强度变化。

结果见图8-10。结果显示，荧光探针rs1、rs2、rs3对sox(x=2，3)的响应基本不受各种常见气体的影响，具有很好的抗干扰能力。

由上述实施例可知，本发明设计了一类基于电子转移机制的“turn-on”型氧杂蒽类荧光探针，并将其用于检测sox(x=2，3)，当sox(x=2，3)存在时，氧杂蒽类荧光探针荧光强度增强，从而实现对sox(x=2，3)的定量检测。该类荧光探针检测sox(x=2，3)的机制为：氧杂蒽类荧光探针与sox(x=2，3)发生作用后，其结构内发生电子转移，螺环结构打开，导致其荧光增强以及溶液颜色变化。该类荧光探针在空气、o2、co2、h2s、n2、nh3气体存在下，对sox(x=2，3)的检测能力基本不受影响。故本发明所述氧杂蒽类“turn-on”型荧光探针对sox(x=2，3)的检测具有检测快速、成本低、特异性好、灵敏度高、易于实现可视化等优点，且可实现so2、so3的同时检测，有望广泛应用于环境工程以及污染气体中sox(x=2，3)的实时检测。