专利名称：用微球体包埋活组织细胞的制作方法
技术领域：
本发明领域属于微球体包埋活组织细胞。一种已知的合成无定型硅胶微球的方法包括在一个容器里放入一种有机硅前体和强酸溶液以及用溶剂化物诺丹明从无定型硅胶微球上洗去多余的有机硅前体的步骤。有机硅前体和强酸溶液是不混溶的。合成无定型硅胶微球的方法还包括加入一种选自诺丹明-6G、-B、铕3+、荧光素、香豆素-120、香豆素-314T、硫堇、铀、和铀敏感的铕的掺杂物，搅拌有机硅前体和强酸溶液，在强酸溶液中形成有机硅前体滴液，其中强酸溶液中的水水解有机硅前体滴液形成无定型硅胶微球，并且用一种溶剂洗涤除去多余的有机硅前体。产物呈荧光性。
在另一个已知的方法中，活的动物组织细胞和微生物细胞，例如，酵母细胞被包埋在由有机硅制备的无机的胶中。组织细胞的包埋是通过用一种有机硅前体与一种强酸水溶液混合，水解有机硅前体而提供一种成胶液，冷却成胶液，形成一种活组织细胞和亨克氏平衡盐溶液的混合物，碱液加入到成胶液，随后，立刻将含有组织细胞的混合液加入成胶液中，然后，把产物混合物倒入一种容器中形成一种无机胶包埋的组织细胞。有机硅前体可以是四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、或四丙氧基硅烷。微生物细胞的包埋采用的是类似的方法，其中成胶液的制备是采用把一种硷加入到用浓酸水溶液水解有机硅产生的溶液中得到的，微生物细胞的分散液与成胶液混合，将产生的混合物倒进一个容器中形成一种无机胶包埋的微生物细胞。
本发明总的来说涉及微球体包埋活组织细胞的方法。用许许多多微球体包埋活组织细胞的这种方法包括的步骤有一种有机金属前体和一种水解液混合形成成胶液；活组织细胞和盐溶液混合，形成一种含有活组织细胞的溶液；含有活组织细胞的溶液和成胶液混合，形成一种一定比重的混合物。
本发明第一个独立的方面，是本方法也包括混合物在一个含有一种油的容器中混合的步骤，搅拌混合物形成许多的微球，而每个微球都包埋着一些活组织细胞。这种油与混合物是不相溶的，它的比重与混合物相比较低。
本发明的第二个独立的方面，这种方法也包括将混合物形成滴液；和将滴液放入一种有油的柱子中的步骤。这种油和混合物是不相溶的，油与混合物相比它的比重较低，在混合物其顶部形成许多微球，而每个微粒体包埋着一些活组织细胞。
本发明的第三个独立的方面，有机硅前体是选自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷所组成的一组有机硅。
本发明的第四个独立的方面，所指的活组织细胞是来自一种动物。
本发明的第五个独立的方面，所指的活组织细胞是来自一种植物。
本发明的第六个独立的方面，所指的活组织细胞是来自真菌。
本发明的第七个独立的方面，所指的活组织细胞是来自细菌。
用这种包埋活组织的方法创造了一种新的药物投送系统，能使活的分泌治疗化合物的细胞移植在体内，而勿需免疫抑制。陶瓷材料(无机非金属)可以用于包埋能分泌治疗药物，而且被移植在寄主(病人)体内摸拟真实的器官投送治疗药物的活组织细胞。
为提高或完成所需要的结果，活组织可通过遗传工程进行改造。陶瓷材料孔隙的大小要足以使治疗的药物分子通过，但孔隙又要足以使移植的细胞与寄主的免疫系统分隔开。非有机的包埋材料在生物学上是惰性的，可减少免疫或自体免疫响应的风险。
通过参照如下详细的描述，其它方面以及伴随的许多优点会更容易看出，同样也更容易被理解。
本发明被认为是新颖的一些特征在附后的权利要求中予以陈述。
；图1．是一个容器和一个搅拌棒的侧视图。容器中含有一种油和按照本发明第一个实施方案由活组织细胞的溶液与成胶液形成的混合物的混合物。
图2．是滴加器和油柱的侧视图。其油柱中含有按照本发明第二个实施方案由活组织细胞的溶液与成胶液形成的混合物的混合物。
优选的实施方案的详细描述一种合成溶胶包埋活组织细胞的方法，包括在第一个容器放入一种有机金属前体和一种水解液，搅拌溶液直到溶液变清，清液在冰浴中冷却，在第二个容器中放入活组织细胞和平衡的盐溶液形成一种组织溶液的步骤。
收获活组织细胞。活组织细胞放入一种平衡盐溶液中形成一种组织溶液。用于人细胞的溶液可以是普通的医用盐水溶液。用于包埋活细胞的盐浓度需要充分平衡以免细胞破碎。U．S．专利No．4，797，213在第六列第10行给出所使用亨克氏平衡盐溶液。活组织细胞可以来自一种植物、一种动物、细菌、真菌或者酵母。
有机金属前体可以是一种有机硅前体，水解液可以是摩尔浓度在0．05至2．5范围的一种强酸。本方法也包括加一种分子浓度在0．05至2．5范围的硷溶液到清溶液中。随后，立刻把组织溶液加入清溶液和硷溶液中，搅拌清液、硷液和组织溶液，形成成胶液，处理该成胶液，得到无机胶包埋活组织细的所需要物理结构。溶液加硷充分中和避免在极端pH下细胞破损。
有机硅前体可以选自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、和甲基三甲氧基硅烷。
有机金属前体可以选自三-正-丙氧基铝、三仲丁氧基铝、乙酰乙酸酯螯合二仲丁氧基铝、三仲丁氧基锆、丁氧基硼、甲氧基硼、丁氧基钛(iv)、异丙氧基钛和异丙氧基锆。强酸选自由硝酸和盐酸。其它可被使用的强酸包括硫酸。在优选的实施方案中，硷溶液是氢氧化铝。请参阅C．J．Brinker，Journalof Non-Crystaline Solutions，volume48，page48 and volume63，page45．由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker编辑的在位于Clifton New Jersey的Humana出版社出版的题目为动物细胞培养一书的第十三章141页描述亨克氏平衡液。
根据K．Lindsey编辑和由Humana出版社出版的题目为植物组织培养手册原理和应用。可以从磨碎的叶子的碎片中得到一种植物组织细胞，将这种叶子的碎片放入平衡盐溶液中形成植物组织溶液。
由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker编辑的位于Clifton的New JerseyHumana出版社出版的题目为“动物组织细胞培养”一书的第十三章141页也描述了一种动物组织细胞的制备。
从包括人在内的哺乳动物的肝、胰、甲状腺、甲状旁腺、脑垂体腺体、肾皮质可以获得一种动物的组织细胞。包埋这些组织细胞其中之一的一种溶胶可以用于一种人造器管，例如，一种人造肝脏或一种人造胰脏。
例如，已从牛肝(牛的肝细胞)获得活的动物组织细胞。将牛肝切成小块是分散活的动物组织细胞的标准程序。取大约10克小块的牛肝放入60毫升的亨克氏平衡盐溶液中放置半小时，目的是为了从牛肝除去血红蛋白。除去亨克氏平衡盐溶液。40毫克的胶原酶和60毫克的中性蛋白酶溶解于亨克氏平衡盐溶液。中性蛋白酶和胶原酶是酶。摇动亨克氏平衡盐溶液半小时，沉淀后成为一种组织溶液。组织溶液是一种有单个的活肝细胞分散在其中的上清液。本发明人已经用一种有机胶包埋了肝细胞。
U．S．专利No．5，270，192给出一种肝细胞反应器，一种生物人工肝，它包括一个具有注入口和注出口的保护外壳，一种基质填充在保护外壳中，以便截留保护外壳内的肝细胞聚集物，同时允许基质流动。
U．S．专利No．4．391．909给出组织细胞如胰岛郎罕氏细胞或肝细胞，它们被包埋在一种用分子量大于3000的多聚物与有酸性基团的多糖交联的一种球形的半渗透膜中。在微胶粒中的细胞是能生存的，健康的，具有生理活性、有进行代谢的能力。包埋的细胞可被移植在哺乳动物体内，以产生活体组织中该细胞特有的物质和化学变化。本发明人用一种有机胶已经包埋了胰岛郎罕氏细胞。
U．S．专利No．5．166．058给出了纯化了的BMP-2蛋白质可以用于骨和软骨缺欠，伤口医治和有关组织修复治疗。对于骨和／或软骨的形成，包括一种具有投送BMP-2A、BMP-2B或其它的BMP蛋白质到骨质和／或软骨损伤的能力的基质的组合物，为骨和软骨的发育提供一种结构，而且可任选地被吸收进体内，这样的基质目前使用的材料可以形成可用于其它的编码骨诱诱导蛋白质的移植医用DNA序列的应用。基质材料的选择要根据生物性、生物降解性、机械性、外观装饰性、界面的性质而定。BMP-2的特定应用决定合适的配方。用于这种组合物的潜在的基质可以是生物可降解的和化学上确定的硫酸钙、三磷酸钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它潜在的材料是生物可降解的，而且生物学上已确切表征的，例如，骨骼或者表皮胶原。其它的基质是由纯蛋白质或细胞外的基质成份组成。其它潜在的基质是非生物降解的和化学上确定的，诸如，烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它的陶瓷。基质可以包含上述类型材料的任何的组合，例如，聚乳酸和羟基磷灰石、或者胶原和三磷酸钙。生物陶瓷在其组成可能改变，例如，钙-铝酸盐-磷酸盐，和在加工过程中进行改变，以改变孔的大小、颗粒大小、颗粒的形状和可生物降解的能力。根据改变BMP-2蛋白质作用的各种因素，即，希望形成的骨骼的重量，骨骼损伤的部位，骨损伤的状况，受伤的程度，损伤组织类型，病人的年令、性别和饮食，任何严重的感染，给药时间以及其它的临床因素，由医生决定用量方式。用药量可随组合物中BMP蛋白质的类型和用于重新构成的基质类型来改变。在终组合物中已知的生长因子，如；IGFI(类胰岛素生长因子I)的加入也可影响用药量。
U．S．专利No．5，453，368的生物物质包括PC-12细胞，该细胞在标准RPMI培养基中培养，用移液管取出细胞放入离心管中，然后离心沉淀细胞。将这些细胞稀释至2毫升，细胞浓度大约为每毫升2×106～5×106。含有液体的细胞被放入无菌Hamilton注射器中，而且放在一个注射泵Harvard装置上。泵是通过规格为18的聚四氟乙烯管连接到一种规格为24的不锈钢管上，它作为液体滴加的一种装置。用1．5％藻朊酸钠溶液(W／V)制备含有牛肾上腺嗜镉细胞的微胶囊。PBS收集浴容器含有1．5％氯化钙。培养六周后，微胶囊含有活的细胞。
用上述的方法，在硅胶中成功地包埋了下列细胞，而且保持其活性。真菌酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae显毛金藻Phanerochaete chrysosporium植物
热半月孢囊(光合作用海藻)Pyrocystis lunula(photosyntheticmarine)红苹果地面复盖叶细胞(从磨碎叶的悬浮液中提取的含有叶绿体的细胞)Red apple ground cover leaf cells(individual chlorophyl-containing cells extracted from supematent of ground leaves)细菌磷发光细菌(生物发光的海洋细菌)Photobacterium phosphoreum(bioluminescent marine bacteria)，嗜砷地螺旋菌Geospirillum arsenophiluf(MIT-13)，盐生盐杆菌Halobacterium halobium．动物鼠胰岛郎格罕氏细胞Murine islets of Langerhans，猪胰岛郎格罕氏细胞Porcine islets of Langerhans，牛肝细胞Bovine hepatocytes，猪肝细胞Porcine hepatocytes，人白血球细胞Human white blood cells，人红血球细胞Human red blood cells，大鼠PC-12细胞(来自嗜铬细胞瘤)Rat PC-12cells(from ratpheochromocytoma)，Lac-z转染鼠间质干细胞(基因工程哺乳动物组织细胞)Lac-ztransfected murine mesenchymal stem cells(genetically engineedmammalian tissue cells)，大鼠成纤维细胞Rat fibroblasts，人成纤维细胞Human fibroblasts，人骨肉瘤细胞Human osteosarcoma cells，中国仓鼠卵巢细胞Chinese hamster ovarian(CHO)cells．图1．所涉及的是公开的一种用微球体包埋活组织细胞的方法。本方法是用许多微球包埋活的组织细胞，它包括有机金属前体和水解液混合形成成胶液；活组织细胞和盐溶液混合形成含有活组织细胞的溶液；含有活组织细胞的溶液和成胶液混合形成一种一定比重的混合物。活组织细胞可以是来自一种动物或来自一种植物。本方法也包括混合物在含有油12的容器11中混合，然后用搅棒13搅拌混合物，形成许多微球体14。每个微球体14包埋着一些活的组织细胞。油12与混合物是不相混溶的，它的比重与混合物的比重相比较轻。有机金属前体可以是一种有机硅前体。有机硅前体可以从四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷一组中挑选。
图2．所涉及的是公开的一种用微球体包埋活组织细胞的方法。本方法用许多微球包埋活的组织细胞，包括，有机金属前体和水解液混合形成成胶液；活的组织细胞和盐溶液混合形成含有活细胞的溶液和含有活的组织细胞的溶液与成胶液混合形成一定比重的混合物。活组织细胞可以是来自一种动物或来自一种植物。该方法也包括混合物形成滴液和将滴液加入到一种含有油112的一个柱11l中的步骤。油112与混合物是不相混溶的，其比重低于混合物的比重，在顶部的位置形成许多微球，每个微球114包着一些活组织细胞。有机金属前体可以是一种有机硅前体。有机硅前体可以从四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷组成的一组中挑选。
从前述部分可以看出，用一种溶胶包埋一种有活性的生物材料，包括已经给以描述过的动物和微生物的组织细胞。因此，前述的公开将被认为仅仅是对本发明原理的一种解释。
权利要求
1．用许多微球包埋活组织细胞的方法包含a．使一种有机金属的前体和一种水解液组合形成一种成胶液；b．使活组织细胞和一种盐溶液组合形成含有活组织细胞的一种溶液；c．使从b步骤得到的含有活组织细胞的溶液与从a步骤得到的成胶液组合形成一种一定比重的混合物；d．将c步骤产生的混合物混入与c步骤产生的混合物不相溶的，比重小于从c步骤产生的混合物的一种油中，形成许多包埋着一些所说的活组织细胞的微球。
2．根椐权利要求1所述的方法，混合步骤包括将这种油和步骤c得到的混合物进行搅拌。
3．根椐权利要求1所述的方法，混合步骤包括将c步骤产生的混合物形成滴液和将滴液滴入油柱顶部。
4．根椐权利要求1、2或3所述的方法，在有机金属前体和水解液相组合的步骤中，该有机金属前体是有机硅前体。
5．根椐权利要求4所述的方法，该有机硅前体选自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷。
6．根椐权利要求1、2或3的方法，该方法还包含e．由步骤b产生的含有活组织细胞的溶液与成胶液组合之前，由步骤a产生的成胶液与一种硷组合，以充分中和成胶液，避免极端pH损伤活组织细胞。
全文摘要
一种用许多微球包埋活组织细胞的方法,包括:有机金属前体和水解液混合形成成胶液;活组织细胞和盐溶液混合形成含有活组织细胞的一种溶液;产生的含有活组织细胞的溶液和产生的成胶液混合形成一定比重的混合物。用许多微球包埋活组织细胞的方法,也包括:将混合物混入一个含有一种油的容器,而且搅拌混合物形成许多微球,每一微球包埋着活组织细胞。这种油和混合物是不相溶的,而且比重低于混合物。
文档编号C09K11/06GK1292816SQ98810291
公开日2001年4月25日 申请日期1998年8月14日 优先权日1997年8月18日
发明者爱德华·J·A·波普 申请人:索尔基因医疗有限公司