专利名称：一种大型藻类的微球体形态及其构建培养方法
技术领域：
本发明涉及藻类细胞培养和生物技术，具体的说是一种大型藻类的微球体形态构 建及培养方法。
背景技术：
利用光生物反应器进行藻类大规模、高密度、高效率培养，是现代生物科学技术的 发展趋势。作为一种发展中的科学技术，国内外都在大力进行研究。大型藻类形态结构分为单细胞多核体、丝状体、假膜体和叶状体等几种类型，其细 胞结构特点使之不能像微藻那样均勻地分布在培养液当中；而且其培养过程中的细胞分化 也会造成培养效率的降低。而且不同藻类的生长条件和生长习性各异，培养中出现的诸如 藻体缠绕、附着、漂浮、聚集或沉降，影响光能、物质的传输，导致了光生物反应器难以实现 其高密度培养的设计要求。要实现大型藻类细胞在光生物反应器条件下的培养，需要构建适宜的藻体形态。 这是反应器技术发展的关键。
发明内容
本发明目的在于构建一种大型藻类的微球体形态及其构建培养。为实现上述目的，本发明采用的技术方案大型藻类的微球体形态大型藻类为具有较强细胞全能性的无性系，构建成直径 小于等于1cm的呈圆球状的藻落形态，即为微球体(microsphere)，构建成的微球体状态使 藻类细胞停滞在构建时的某一生长阶段不再继续分化，进而通过光生物反应器进行大量扩 繁。所述微球体根据其结构特点划分，其不同的表达形式由不同藻类的细胞结构决定，分为 3种类型绒球状，由单列细胞丝状体构成，藻丝呈辐射状向外生长；第二种是网状，由多列 细胞组成的假膜体(线状)分支交织而成；第三种是簇生，由幼叶状体簇生而成，同时有的 夹杂后发生的单列细胞丝状幼体。所述微球体的构建过程如下对将要构建微球体的大型藻，取其无性系，将其分 散、打碎，在藻类生物反应器中进行通气悬浮培养，利用微重力和向光性的双重作用，使藻 类细胞向四周全方位生长，5-10天即可获得形态稳定均勻的球状微球体。将分散、打碎的无性系藻类细胞置于质量比1.5-3%的褐藻酸钠溶液中，充分混 合使之分散均勻，而后将褐藻酸钠藻段溶液全部滴入o. l-o. 2M的CaCl2溶液中进行固化 10-30分钟，其中液滴大小即为所得微球体的大小，可根据需要选择、控制，即可获得包埋着 藻体细胞的褐藻胶球；将包埋着藻体的小球于培养液中静止培养7-14天，即可获得较为稳 定的微球体。所述分散、打碎的无性系藻类细胞是将大型藻用物理方式切段获得大小均一的藻 段，藻段在0. 5-5mm。所述通气悬浮培养是相反应器去通气使培养液体表面平稳翻动、无大 量气泡破碎的状态；同时在光照强度为30-90 u Em^s-1下培养。
本发明所具有的优点本发明构建的微球状藻体为直径< 1cm的圆球状，可以有 效解决大型藻类在反应器培养过程中，出现的缠绕、贴壁和藻体成团漂浮或下沉等问题，从 而使光生物反应器实现大型藻高密度培养。因此，利用细胞工程技术，诱导藻类外植体的 细胞全能性表达，获得具有强扩繁能力的藻类微型无性系——丝状体。以各种藻类的无性 系为起始材料，通过培养条件的控制，将原本无序生长的丝状体，构建成一定大小的球状藻 落，得到适合反应器培养的微球体(microsphere)，并能够大量培养、扩繁。
图1为本发明实施例构建所得绒球状微球体(蜈蚣藻)。图2为本发明实施例构建所得网团状微球体(多管藻)。图3为本发明实施例构建所得簇生状微球体。(孔石莼)。
具体实施例方式实施例1大型海藻选择蜈蚣藻(Grateloupia filicina)丝状体，用物理方式即手术剪切段 或用磁力搅拌器打碎成2mm左右的藻团。将藻团于藻类光生物反应器中进行培养。藻类生物反应器表面光照强度为 45-70 iiEn^s—1，光暗周期为12h 12h。反应器中连续通入无菌空气，将进气量控制在培养 液体表面平稳翻动、无大量气泡破碎的状态；常温下培养5天左右，原无性系藻丝呈辐射状 向外生长，形成均勻的球状藻落，即得到绒球状微球体(参见图1)。另外紫菜(Porphyra yezoensis)丝状体，海带(Laminaria japonica)禾口裙带菜(Undaria pinnatifida)的配子 体也可构建成绒球状微球体。或者将打碎的丝状体藻团混合到一定量的质量比浓度为2%的褐藻酸钠溶液中， 使之分散均勻，用滴管或注射器滴于0. 15M的CaCl2溶液中固化。20分钟后从溶液中取出 包埋着藻体的褐藻胶小球，用消毒海水清洗，于培养液中静止培养。12天后，即可获得呈球 形生长的绒球状微球体，可用于光生物反应器培养。大型海藻在形成微球体后，将停滞在这一生长阶段而不会发育分化；而且由于藻 体细胞都具有再生能力，利用这一特性可以将这些微球体不断剪碎培养，大量扩增为新的 微球体。所述藻段培养时的培养液为PES培养基配方或其它常规藻类培养液。实施例2与实施例1不同之处在于大型海藻选择多管藻(Polysiphonia urceolata)丝状体无性系，将藻体用物理方 式即手术剪刀剪碎，获得l_3mm左右的丝状体藻段。所述藻段置于2% (质量比)褐藻酸钠溶液中使之分散均勻，而后用细滴管将混 合有藻丝的褐藻酸钠溶液滴于0. 1M的CaCl2溶液中进行固化，15-30分钟后获得包埋着藻 体的藻胶球，消毒海水清洗后，于培养液中静止培养，培养液采用PES海水加富型培养基配 方，温度控制在20°C左右，光强eOiiEn^s—1左右，光暗周期为12h 12h。每5天更换一次培 养液。2周左右原包埋的丝状藻体即可在藻胶球中呈球状生长，，即得到网状微球体(参见
4图2)，是由多列细胞组成的假膜体(线状)分支交织而成。类似能形成网状微球体结构的 海藻还有细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)、刚毛藻等(Cladophora sericioides)。或者直接将物理方式切割后的藻丝，于藻类生物反应器中连续通气培养，在微重 力和向光性的双重作用下，藻丝向四周全方位生长，形成球状藻落，即得到网状微球体。实施例3与实施例1不同之处在于大型海藻选择孔石莼(Ulva pertusa)，将藻体用物理方式即用手术刀切碎成1mm 左右的片段。将切碎的藻体片段于藻类光生物反应器中培养。反应器表面入射光强约 为gSyEnT、-1，光暗周期为12h 12h;向生物反应器中连续通入无菌空气，通气量为 0. lSm^tr1，室温(20°C左右)下培养7天左右，藻体以各藻体片段为中心向四周辐射生长 形成球状藻落，即得到簇生微球体(参见图3)，是由幼叶状体簇生而成，同时有的夹杂后发 生的单列细胞丝状幼体。另外浒苔(Enteromorpha prolifera)，海带、裙带菜幼孢子体也将 构建成簇生微球体。或者将切碎的藻体于浓度为2% (质量比)的褐藻酸钠溶液中分散均勻，用滴管滴 于0. 1M的CaCl2溶液中进行固化，15分钟后可获得包埋着藻体的小球，将包埋着藻体的藻 胶球于培养液中静止培养10天左右，可获得在藻胶球内呈球生长的微球体。上述构建所得微球体大小可控制在5mm-15mm，从而能够利用光生物反应器进行高 密度培养(培养密度可达30g Fff/L以上)，具有较高的光能利用效率而不会出现附壁、缠 绕、细胞分化等不利于藻体扩繁的情况。此外，淡水大型藻类亦可上述办法，通过人工调控将之构建成微球体 (microsphere)0上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种大型藻类的微球体形态，其特征在于大型藻类为具有较强细胞全能性的无性系，构建成直径小于等于1cm的呈圆球状的藻落形态，即为微球体(microsphere)，构建成的微球体状态使藻类细胞停滞在构建时的某一生长阶段不再继续分化，进而通过光生物反应器进行大量扩繁。
2.按权利要求1所述的大型藻类的微球体形态，其主要特征在于所述微球体根据其 结构特点划分，其不同的表达形式由不同藻类的细胞结构决定，分为3种类型绒球状，由 单列细胞丝状体构成，藻丝呈辐射状向外生长；第二种是网状，由多列细胞组成的假膜体 (线状)分支交织而成；第三种是簇生，由幼叶状体簇生而成，同时有的夹杂后发生的单列 细胞丝状幼体。
3.按权利要求1所述的大型藻类的微球体形态的构建培养方法，其特征在于所述微 球体的构建过程如下对将要构建微球体的大型藻，取其无性系，将其分散、打碎，在藻类生 物反应器中进行通气悬浮培养，利用微重力和向光性的双重作用，使藻类细胞向四周全方 位生长，5-10天即可获得形态稳定均勻的球状微球体。
4.按权利要求3所述的大型藻类的微球体形态的构建培养方法，其特征在于，将分散、 打碎的无性系藻类细胞置于1. 5-3%的褐藻酸钠溶液中，充分混合使之分散均勻，而后将褐 藻酸钠藻段溶液全部滴入0. 1-0. 2M的CaCl2溶液中进行固化10-30分钟，即可获得包埋着 藻体细胞的褐藻胶球；将包埋着藻体的小球于培养液中静止培养7-14天，即可获得较为稳 定的微球体。
5.按权利要求3或4所述的大型藻类的微球体形态的构建培养方法，其特征在于所 述分散、打碎的无性系藻类细胞是将大型藻用物理方式切段获得大小均一的藻段，藻段在 0. 5_5mm0
6.按权利要求3所述的大型藻类的微球体形态的构建培养方法，其特征在于所述通 气悬浮培养是相反应器去通气使培养液体表面平稳翻动、无大量气泡破碎的状态；同时在 光照强度为30-90 μ EnT2s-1下培养。
全文摘要
本发明涉及藻类细胞培养和生物技术，具体的说是一种具有较强细胞全能性、处于未分化状态的大型藻类无性系形态构建。所述构建形态为球状藻落，即微球体(microsphere)。本发明构建的微球状藻体为直径小于1cm的圆球状。本发明能够有效解决大型藻培养过程中出现的贴壁、藻体成团漂浮或下沉以及与反应器部件缠绕等问题，便于光生物反应器进行高密度培养。
文档编号C12N11/10GK101864409SQ20101018026
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者周百成, 王金霞, 董逸 申请人:中国科学院海洋研究所