含高能磷酸键的荧光染料的制作方法
【专利摘要】含高能磷酸键的荧光染料，所述荧光染料具有通式I的结构，如附图1。该类荧光染料在活细胞非线粒体内具有较低的荧光背景，在活细胞中线粒体区域内具有较强的荧光信号，且对活细胞内三磷酸腺苷酶具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
【专利说明】
含高能磷酸键的荧光染料
技术领域
[0001] 本发明涉及一类含高能磷酸键的荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料 对活细胞或组织中三磷酸腺苷酶的识别和定量、动态可视化检测。
【背景技术】
[0002] 三磷酸腺苷酶(Adenosine Triphosphatase)即ATP酶，主要存在于细胞质膜和液 泡膜中。该酶是一种可催化三磷酸腺苷(ATP)水解生成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子的一 种生物活性辅酶。在这个催化水解过程中，ATP酶可使得生物体系释放出大量的能量 (Annu. Rev. Biochem. 1967，36:727-756)。此能量释放过程广泛存在于所有已知的生命形式 中。ATP酶作为一种辅酶具有改善肌体代谢的作用，同时它可广泛参与体内脂肪、蛋白质、 糖、核酸、核苷酸等代谢过程。在它催化水解过程中，释放的能量又是体内吸收、分泌、肌肉 收缩以及进行生化合成反应等生命过程中所需能量的主要来源。因此，在心肌病、肝炎、进 行性肌萎缩、神经性耳聋等疾病的治疗中，常将ATP酶作为研究对象。近些年来，因 ATP酶具 有广泛用于改善机体代谢功能，其常被看做是心脏病能量合剂中的重要成分之一。所以建 立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的、特异性识别和定量、动态监测细胞或组织内的ATP 酶以及可对其进行定量成像的技术或方法是一项重要的工作。
[0003] 现有识别及检测ATP酶的方法种类很多，例如生物发光法、酶联免疫分析法、沉淀 色素强度分析法等。但上述方法在实际活细胞或组织成像应用中存在很多缺陷，例如:无法 实现活生物样品的检测、无法穿越细胞组织外膜、无法实时动态的监测等等。近些年，荧光 染料结合不断发展的显微成像技术为消除上述缺陷提供了一种可行的重要显微监测工具， 以荧光染料作为核心的光学分子成像技术为ATP酶的相关基础研究提供了一种潜在的可视 化工具。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(A0)、咪唑类(H 〇echst、DAPI)和花菁家族类（Cy、 T0T0、SYT0)等荧光染料都已经成为荧光染料研究的核心对象分子。然而，这些染料在ATP酶 活性的实时动态监测时具有一些无法改变的缺点。比如：菲啶染料类中的溴化乙锭(EB)作 为荧光染料具有很好的光学性质，但其具有较高的生物致癌性。更重要的是，这些传统的荧 光染料在荧光稳定性、近红外定靶激发、高分辨率的暗场成像、生物样品的自发荧光干扰等 方面具有很大的缺陷（Nature，1999，2: 989-996 ?; Science，1997，275 : 530 ? ;Angewandte Chemie International Edition，2001,40:2098 ?)。因此，设计合成并制备低/无毒性、高膜 通透性、高选择性识别和定量、实时动态监测活生物样品（细胞或组织）中的ATP酶活性的荧 光染料仍然存在巨大挑战。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的首先在于提供一类含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：
[0006] 通式I中：
[0007] 所述的心和1?2各自独立选自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2)nNHCH3、-0(CH2) nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH3、-0P(0)(CH2) n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0) (CH2)nNHCH3、-0P(0)(CH2) nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH2) nP(0)0H、-0P(0) (CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2)nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2) nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0)(CH 3)0-]n、CH3[P(0)(CH3)0-]n、-OH 或-H，其中 n 是 1-8 的整数；
[0008] 所述的 R3选自：CP烷基、-CN、- (CH2) P0H、- (CH2) P0CH3、- (CH2) P0 (CH2) qOH、-NH (CH2) PCH3、_NH (CH2) PNH2、_ (CH2) PNH (CH2) qCH3、_NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、_NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2)PCH3或-(CH2)PN( CH3) (CH2) qCH3，其中 p和q各自独立地选自卜8的整 数；
[0009] 所述的 L选自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0 (CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH2) x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNHC(0)-、-NH(CH2)xC(0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH (CH2) y0-，其中 x和y 各自独立地选自 1 -8 的整 数；
[0010] 所述的M选自：
[0012] 上述基团的结构式中，"一"用以表示该基团与化合物其它部分连接的游离键。
[0013] 本发明另一方面的目的在于提供上述含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括 如下步骤：
[0014] 1)H-M-Br与R3-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R3-M-Br;
[0015]反应温度为0_200°C，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、 丙酮、1，4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0016] 2)化合物R3-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R 3-M-L-H:
[0017] 反应温度〇-180°c，反应时间卜36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；
[0018] 3)化合物R3-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I:
[0020] 反应温度25-160°C，反应时间1-15小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物;缩合剂选自1-(3_二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC1)、二环己基碳二亚胺(DCC);催化剂选用4-二甲氨基吡 啶。
[0021]上述关于本发明的含高能磷酸键荧光染料的制备方法的描述中，各个取代基的定 义，即对Ri、R2、R3、L、和M的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
[0022]本发明所述的含高能磷酸键荧光染料可以近红外定靶激发，在细胞和组织内对三 磷酸腺苷酶有强的荧光响应信号，可用于特异专一性的比例标记和定量、实时动态检测活 细胞活组织中三磷酸腺苷酶活性的小分子荧光染料。并且这类荧光染料具有良好的水溶 性，以及优秀的细胞膜通透性。同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围 与生物样品的光谱范围有足够大的差异，可以避免生物自发荧光的产生。
[0023]因此，本发明再一方面的目的在于提供上述含高能磷酸键荧光染料在生物检测与 标记中的应用。尤其优选应用于目标物为活细胞或肿瘤组织中的三磷酸腺苷酶活动的实时 动态监测与标记。
【附图说明】
[0024]本发明附图14幅：
[0025]图1是本发明的含高能磷酸键的荧光染料的结构通式I。
[0026]图2是化合物心的水溶性检测试验结果。
[0027]图3是化合物心活细胞内成像试验的测定结果。
[0028]图4是化合物心在活细胞内对三磷酸腺苷酶比例识别成像结果。
[0029]图5是化合物心在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验结果。
[0030]图6是化合物知对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。
[0031]图7是荧光染料化合物六2在水溶液中对光的稳定性的检测试验结果。
[0032]图8是化合物知在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验结果。
[0033]图9是化合物A3对活细胞中线粒体共定位成像结果。
[0034]图10是化合物A3在水溶液中对三磷酸腺苷酶的检测试验结果。
[0035]图11是化合物A3对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。
[0036]图12是化合物A4对活细胞的细胞毒性测试结果。
[0037]图13是化合物A4的水溶解性表征结果。
[0038]图14是化合物A4对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。
【具体实施方式】
[0039]除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0040] 本文中使用的术语"烷基"包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名 称，如"丙基"、"异丙基"或"环丙基"，特指具体碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。 如概括形式的描述，如"&- 8烷基"，则包括碳原子数满足要求的所有基团，"&-8烷基"包括但 不限于&-6烷基、&- 5烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基 等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
[0041] 本发明首先提供一类含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：
[0043] 通式I中：办、1?2和R3为不同取代基;M为荧光团；L为连接臂。
[0044]所述的心和1?2各自独立选自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2)nNHCH3、-0(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH 3、-0P(0)(CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0) (CH2) nNHCH3、-0P(0)(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH 3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0) (CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P (0) (CH3)0-]n、CH3[P(0) (CH3)0-]n、-〇H 或-H〇
[0045] 优选的实施方式中，所述的以和心各自独立地选自：-0P(0)(CH2) nCH3、-0P(0) (CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH 2、-0P(0)(CH2)nNHCH3、-0P(0)(CH 2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2) nP(0) CH3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0)(CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0) N(CH3)2、H0[P(0) (0H)0-]n、H0[P(0) (CH3)0-]n、CH3[P(0) (CH3)0-]n、-〇H 或-H〇
[0046] 更为优选地，所述的RjPR2各自独立地选自H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH 3)0-]n、 CH3[P(0)(CH3)0-]n、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P(0)(CH3)0-]n、-0P(0)(CH2) nP(0)0H、-0P(0) (CH2)n0H、-OH〇
[0047] 进一步优选的实施方式中，所述的心和办各自独立地选自H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0) (CH3)0-]n 和 CH3[P(0) (CH3)0-]n。
[0048]再进一步的优选实施方式中，所述的办和办各自独立地选自H0[P(0)(0H)0-]J^H0 [P(0)(CH3)0-]n〇
[0049] 上述对取代基心和办的描述中，所述及的P(0)代表磷氧双键，H0[P(0)(0H)0-]n、H0
[P(0)(CH3)0-]n、CH3[P(0)(CH3)0-]r^ v别表示为式 i、ii 和 iii:
[0051 ] 上述对取代基Ri和R2的描述中，n是1-8的整数，优选1-4的整数。
[0052]上述通式I 中，R3 选自：CP 烷基、-CN、-(CH2)P0H、-(CH2)P0CH 3、-(CH2)P0(CH2)q0H、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) PNH2、_ (CH2) PNH (CH2) qCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2) PCH3或-(CH2)PN(CH3) (CH2) qCH3;优选所述的R3选自 CP烷基、-CN、-(CH2) P0H、- (CH2) P0CH3、_NH (CH2) PCH3、_NH (CH2) PNH2、_NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、_NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2) PCH3或-(CH2) PN (CH3) (CH2) qCH3;更优选所述的R3选自 CP烷 基、-CN、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3;最为 优选的，所述的R3优选CP烷基和-CN。
[0053] 上述对取代基R3的描述中，p和q各自分别选自1-8的整数，优选各自独立地选自1- 4的整数。
[0054]上述通式 I 中，所述的 L 选自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0 (CH2)y-、-0(CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH2) x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNHC(0)-、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH (CH2) y0-;优选所述的 L选自 Cx 烷基、-0 (CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0(CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH 2)x-、-(CH2) XNH-、-NH (CH2) XNH-、-NH (CH2) XNHC (0) -、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y-、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH(CH2) y0-;更为优选的，所述的L选自-NH(CH2) XNH-、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2)yNH-或-NH(CH2) XC(0) NH-、。所述的L尤其优选-NH(CH2)XNH-或-NH(CH2) XC(0) NH-〇
[0055]上述对L的描述中，所述的x和y各自独立地选自1-8的整数;优选1-4的整数。
[0056] 上述通式I中，所述的M选自：
[0058] 优选的技术方案中，M选自或M5
[0059] 最为优选地，所述的M选自M2或M5。
[0060] 以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发 明所述及的范围。
[0061] 优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，所述的高能磷酸 键的荧光染料，选自化合物Ai-A4:
[0063] 另一方面，本发明提供了上述本发明含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括 如下步骤：
[0064] 1)H-M-Br与R3-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R3-M-Br;
[0065] 反应温度为0_200°C，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、 丙酮、1，4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0066]【具体实施方式】中，所述步骤1)的反应温度优选25-180°C，更优选50-180°C，最优选 60-150°C;所述的反应时间优选1-23小时，更优选1-22小时，最优选1-20小时;所述的反应 溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1，4_二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物， 更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、1，4_二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选乙 醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0067] 2)化合物R3-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R 3-M-L-H:
[0068] 反应温度0-180°C，反应时间1-36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；
[0069]【具体实施方式】中，所述步骤2)的反应温度优选30-180°C，更优选30-160°C，最优选 30-140 °C;所述的反应时间优选1-30小时，更优选1-28小时，最优选2-24小时;所述的反应 溶剂优选乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物， 更优选乙醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物，最优选乙 醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物;化合物R 3-M-Br与化合物H-L-H进 行反应优选摩尔比1:1-1:4.5,更优选1:1-1:4,最优选1:2-1: 4。
[0070] 3)化合物R3-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I:
[0072] 反应温度25-160°C，反应时间1-15小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物;缩合剂选自1-(3_二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC1)、二环己基碳二亚胺(DCC);催化剂选用4-二甲氨基吡 啶。
[0073]【具体实施方式】中，所述步骤3)的反应温度优选30_160°C，更优选30_150°C，最优选 30-140 °C;所述的反应时间优选1-14小时，更优选4-13小时，最优选5-12小时;所述的反应 溶剂优选乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，更 优选乙醇、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，最优选乙醇、乙酸乙 酯、N，N-二甲基甲酰胺、醋酸或其混合物;R 3-M-L-H与化合物B进行反应优选摩尔比1:1-1: 5.5,更优选 1:1-1:5,最优选 1:1-1:4.5。
[0074] 对本发明采用上述方法合成的含高能磷酸键的荧光染料化合物，采用核磁共振谱 图或质谱来确认其结构。
[0075] 本发明所述的含高能磷酸键的荧光染料具备以下优点：
[0076] 所述染料化合物引入了与三磷酸腺苷酶特异性结合位点，提高了染料对活细胞和 组织中三磷酸腺苷酶检测和识别的专一性、特异性。
[0077]所述染料化合物具有优异的光学性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂 白、光损伤和生物毒性。
[0078]所述染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化。
[0079] 鉴于此，本发明所述的荧光染料可用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记。除了以本 文中所述的形式直接用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记，含有本发明的荧光染料化合物的 组合物也可以用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记和实时动态监测。所述组合物中应当包含 有效量的本发明所提供的荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的 其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶 液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
[0080] 本发明还提供使用上述本发明的荧光染料化合物标记和动态实时监测活细胞中 三磷酸腺苷酶的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术 语"接触"可包括在溶液或固相中接触。
[0081] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0082] 实施例1
[0083]制备荧光染料化合物心，采用如下合成路线：
[0085] (1)化合物1-2的合成
[0086] 将20mmol化合物1-1和30mmola-氨基丙酸加入到含有l〇ml乙醇溶液的圆底烧瓶 中，氮气保护。反应加热回流持续反应16h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得紫 色固体粉末粗产品，化合物1 -2，收率93 %。
[0087] (2)化合物心的合成
[0088] 将20mmol化合物1-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125°C回流持续反应12h后停止。减压蒸出 溶剂，柱色谱分离得深红色固体粉末化合物Ai，收率42 %。4 NMR(400MHz，DMS0) S10.11 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.75(s，lH)，7.73(s，lH)，7.47(s，lH)，7.40(s，lH)，6.65(s，lH)， 6.03(s,lH),4.53(s,lH),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.71-3.69(s,2H),3.31(m,2H), 2.42(m,2H).
[0089] 实施例2
[0090] 荧光染料化合物^的水溶性检测试验
[0091] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物Ai加入到水中，测定在不同浓度（0.6， 2.0,2.7,3.3,5.0,6.6,9. OyMMi水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图2，结果显 示：当化合物Ai浓度为9. OyM时，吸光度值未发生偏移，即荧光染料化合物心在水中的溶解度 为9.OyM。图2为不同探针Ai浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453 紫外分光光度计。
[0092] 实施例3
[0093]荧光染料化合物^活细胞内成像试验
[0094]使用上述实施例合成的荧光染料化合物心，以终浓度为10.0 yM的心分别孵育HepG2 细胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min X 3，再加入细胞培养基，激光共 聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40X)观察，重复三次。实验结果表明：荧光染料化合物 八1在11叩62细胞胞质中的有强荧光信号。图3的荧光采集波段为560-650nm。
[0095] 实施例4
[0096] 荧光染料化合物心在活细胞内对三磷酸腺苷酶比例识别成像的试验
[0097]使用上述实施例合成的荧光染料化合物Ai，以终浓度为孵育HepG2细 胞，在37°C，5%C02孵育30分钟。实验组内再加入ATP酶抑制剂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂 洗5minX 3,再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40 X)观察，重 复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm〇 [0098] 实验结果如图4所示，表明：荧光染料化合物六:对照组HepG2细胞胞质中在585- 620nm(对照组图4a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号（对照 组图4b)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合 物八1在585-62〇11111(实验组图4c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减弱 (实验组图4d)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。此实 验结果表明荧光染料化合物^在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。
[0099] 实施例5
[0100]荧光染料化合物^在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验 [0101]使用上述实施例中合成的荧光染料化合物Ai加入到水中，对不同浓度三磷酸腺苷 酶的识别。测试结果如图5所示，显示：当化合物六:浓度为5.OiiM时，随着三磷酸腺苷酶的增 加，化合物荧光在540nm的强度逐渐减弱。下图为不同浓度三磷酸腺苷酶作用下Ai荧光 光谱变化。
[0102] 实施例6
[0103] 制备探针化合物A2:
[0105] (1)化合物2-2的合成
[0106] 将20mmol化合物1-1和30mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮 气保护。反应加热回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得紫色固体 粉末粗产品，化合物2-2，收率87 %。
[0107] (2)化合物A2的合成
[0108] 将20mmol化合物2-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125°C回流持续反应16h后停止。减压蒸出 溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A2，收率53 %。M1R (40OMHz，DMSO) S1 〇 . 14 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.49(s，lH)，7.39(s，lH)，6.66(s，lH)， 6.05(s，lH)，4.54(s，lH)，4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29(m，4H)，2.42(m，2H).
[0109] 实施例7
[0110]荧光染料化合物知对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别
[0111] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A2,以终浓度为lO.OyM的厶2分别孵育HepG2 细胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分钟。然后，加入三磷酸腺苷酶抑制剂，孵育lh，PBS震荡漂洗 5minX 3,再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40 X)观察，重复 三次。实验结果如图6所示，表明：荧光染料化合物六2在11叩62细胞中随着三磷酸腺苷酶抑制 剂孵育时间增长，其荧光信号减弱。图6中：（a)为对照组，未加入三磷酸腺苷酶抑制剂；（b) 为实验组，加入100.0 yM的三磷酸腺苷酶抑制剂；图6的荧光采集波段为560-650nm。
[0112] 实施例8
[0113] 荧光染料化合物六2在水溶液中对光的稳定性的检测试验
[0114] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A2加入到水中，测定在其在不同时间 (5.0、10.0和15min，以及7.Oh)下的A 2荧光光谱变化。测试结果为图7,结果显示：当化合物A2 浓度为5. OyM时，随着照射时间的逐渐延长，化合物六2的荧光强度在560-650nm保持不变，时 间可持续7.Oh。图7为其在不同时间下的A 2荧光强度变化。所用仪器分别是Agilent荧光分 光光度计。
[0115] 实施例9
[0116] 荧光染料化合物知在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验
[0117] 使用上述实施例中合成的荧光染料化合物A2加入到水中，对不同浓度(2.0,4.0， 6.0，8. Oand 10.0 yM)三磷酸腺苷酶的识别。测试结果如图8，显示：当化合物A2浓度为5. OyM 时，随着三磷酸腺苷酶的增加，化合物如的荧光在540nm的强度逐渐减弱。下图为不同浓度 三磷酸腺苷酶作用下知荧光光谱变化。
[0118] 实施例1〇
[0119] 制备荧光染料化合物A3
[0121] (1)化合物3-1的合成
[0122] 将20mmol 4-溴-1，8_萘酐和25mmol丁胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中， 氮气保护。反应加热回流持续反应l〇h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固 体粉末粗产品，化合物3-1，收率92 %。
[0123] (2)化合物3-2的合成
[0124] 将20mmol化合物3-1和200mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮 气保护。反应加热回流持续反应12h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体 粉末粗产品，化合物3-2，收率87 %。
[0125] (3)荧光染料化合物A3的合成
[0126] 将20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125°C回流持续反应16h后停止。减压蒸出 溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A 3，收率33 %。M1R (400MHz，DMS0) S1 〇 . 14 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.54(s，lH)，7.50(s，lH)，7.49(s，lH)， 7.39(s，lH)，6.66(s，lH)，6.05(s，lH)，4.54(s，lH),4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29 (m,4H),2.42(m,2H),1.13-1.02(m,7H).
[0127] 实施例11
[0128] 荧光染料化合物A3对活细胞中线粒体共定位成像
[0129] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A3,以终浓度为lO.OyM的A3分别孵育HepG2 细胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min X 3，再加入细胞培养基，激光共 聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40X)观察，重复三次。通过数据分析，得出图9的散点 分析结果。如图9所示，结果显示:荧光染料化合物A 3在HepG2细胞中线粒体有强荧光信号。
[0130] 实施例12
[0131] 荧光染料化合物A3在水溶液中对三磷酸腺苷酶的检测试验
[0132] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A3加入到水中，测定在不同浓度（2.0， 4.0，6.0，8. Oand 10.0 yM)三磷酸腺苷酶作用下A3紫外光谱变化。测试结果为图10，结果显 示：当化合物A3浓度为5. 时，随着三磷酸腺苷酶的增加，化合物A3的紫外强度逐渐减弱。 图10为不同浓度三磷酸腺苷酶作用下A3紫外光谱变化。所用仪器分别是Agilent 8453紫外 分光光度计。
[0133] 实施例13
[0134] 荧光染料化合物A3对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别
[0135] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A3,以终浓度为lO.OyM的A3孵育HepG2细 胞，在37°C，5%⑶ 2孵育30分钟。实验组内再加入三磷酸腺苷酶抑制剂孵育30分钟。然后， PBS震荡漂洗5min X 3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40 X)观察，重复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm〇
[0136] 实验结果如图11所示，表明：荧光染料化合物A3对照组HepG2细胞胞质中在585-620nm(对照组图11a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号（对照 组图1 lb)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合 物A3在585-620nm(实验组图11c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减 弱（实验组图lid)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。 此实验结果表明荧光染料化合物A 3在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。
[0137] 实施例14
[0138] 制备荧光染料化合物A4
[0140] (1)荧光染料化合物A4的合成
[0141] 将20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热120°C回流持续反应14h后停止。减压蒸出 溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A 3，收率33 %。M1R (400MHz，DMS0) S1 〇 . 14 (m， 3H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.54(s，lH)，7.50(s，lH)，7.49(s，lH)， 7.39(s，lH)，6.66(s，lH)，6.05(s，lH)，4.54(s，lH),4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29 (m，4H)，2?42(m，2H)，1?43-1?39(m，9H)，1?13-1?02(m，7H)?
[0142] 实施例15
[0143] 荧光染料化合物六4对活细胞的细胞毒性
[0144] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A4，以不同终浓度(3.0和1 OyM)的A4分别孵 育HepG 2细胞，在37°C，5%C02孵育24h。然后，PBS震荡漂洗5min X 3，再加入MTT用酶标仪测 定，重复三次。测试结果如图12所示，显示：不同浓度的荧光染料化合物A4孵育对HepG 2细 胞24小时之后，仍有90 %细胞存活。
[0145] 实施例16
[0146] 荧光染料化合物A4的水溶解性检测试验
[0147] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A4加入到水中，测定在不同浓度（2.0， 4.0，6.0，8. Oand 10.0 yM)荧光染料化合物A4水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果如 图13所示，显示当荧光染料化合物A2浓度为6. OyM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A4在水 中的溶解度为6.OyM。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
[0148] 实施例17
[0149] 荧光染料化合物A4对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别
[0150] 使用上述实施例合成的荧光染料化合物A4,以终浓度为lO.OyM的A4孵育HepG2细 胞，在37°C，5%⑶2孵育30分钟。实验组内再加入三磷酸腺苷酶抑制剂孵育30分钟。然后， PBS震荡漂洗5min X 3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40 X)观察，重复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm〇
[0151] 实验结果如图14所示，表明：荧光染料化合物A4对照组HepG2细胞胞质中在585-620nm(对照组图14a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号（对照 组图14b)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合 物A4在585-620nm(实验组图14c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减 弱（实验组图14d)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。 此实验结果表明荧光染料化合物A 4在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。
[0152] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于 荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光 染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应 用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：通式I中： 所述的 Ri和R2各自独立选自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2) nNHCH3、-0(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH 3、-0P(0)(CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0)(CH2) nNHCH3、-0P(0)(CH2)nN(CH3) 2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH 2)nP(0)0H、-0P(0)(CH2)nP (0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P(0) (〇13)0-]"、〇13[?(0)(〇1 3)0-]11、-0!1或-!1，其中11是1-8的整数； 所述的 R3选自：CP烷基、-CN、-(CH2)P0H、-(CH2) P0CH3、-(CH2)P0(CH2) q0H、-NH(CH2)PCH3、-NH (CH2) PNH2、- (CH2) PNH (CH2) qCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-（ CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N( CH3) (CH2) PCH3或-(CH2) PN( CH3) (CH2) qCH3，其中 p和 q各自独立地选自 1 -8 的整数； 所述的 L选自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0(CH2)x0 (CH2)y0-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNH-、-NH(CH2)xNHC(0)-、-NH(CH2)xC(0)NH-、-NH (CH 2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH(CH2)xO(CH2) yNH-或-〇(CH2)xNH(CH2)y〇-，其中 x和y 各自独立地选自 1-8 的整数； 所述的Μ选自：2. 根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于:所述的RdPR2各自独 立地选自：-0P (0) (CH2) nCH3、-0P (0) (CH2) n0H、-0P (0) (CH2) nNH2、-0P (0) (CH2) nNHCH3、-0P (0) (CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH 2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0)(CH 2)nP(0)NH2、-0P(0) (CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH 3)2、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH3)0-] n、CH3[P(0) (CH3)〇-]n、-〇H或-H，其中n是1-8的整数。3. 根据权利要求2所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于:所述的RjPR2各自独 立地选自 H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH3)0-]n、CH 3[P(0)(CH3)0-]n、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0) (CH3)0-]n、-0P(0) (CH2)nP(0)0H、-0P(0) (CH2)n0H、-OH，其中 η 是 1-8 的整数。4. 根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的R3选自心烷 基、-CN、-(CH2) P0H、-(CH2)P0CH3、-NH(CH2)PCH3、-NH(CH2) PNH2、-NH(CH2)P0(CH2)qCH3、-(CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3 或-(CH2) PN (CH3) (CH2) qCH3，其中 p 和 q各自分别 选自1-8的整数。5. 根据权利要求4所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于:所述的所述的R3选自 CP 烷基、-CN、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3， 其中P和q各自分别选自1-8的整数。6. 根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于:所述的L选自&烷基、_ 0(CH2) x-、-(CH2)x0-、-0(CH2)x0-、-0(CH 2)x0(CH2)y-、-0(CH2) x0(CH2)y0-、-NH(CH2)x-、-(CH 2) XNH-、-NH (CH2) XNH-、-NH (CH2) XNHC (0) -、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2)厂、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2)xNH(CH2) y〇-，其中x和y各自分别选自1-8的整数。7. 权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于:M选自8. 权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括如下步骤： 1 )H-M-Br与R3-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R3-M-Br; 反应温度为0-200 °C，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 1，4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 2) 化合物R3-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R3-M-L-H : 反应温度0_180°C，反应时间1-36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三 醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物； 3) 化合物R3-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I:反应温度25-160°C，反应时间1-15小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物；缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC1)、二环己基碳二亚胺(DCC);催化剂选用4-二甲氨基吡 啶。9. 权利要求1-7中任一权利要求所述的含高能磷酸键的荧光染料在生物检测与标记中 的应用。10. 权利要求9所述的应用，其特征在于所述的生物检测与标记目标物为细胞或组织中 的三磷酸腺苷酶。
【文档编号】C09K11/06GK105820597SQ201610255237
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月24日
【发明人】仉华, 王亚甫, 吴呈珂, 陈粤华, 郭海明, 程定玺
【申请人】河南师范大学