一种聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和用途，其制备方法包括以下步骤：将式I所示的聚集诱导发光化合物和两亲性聚合物溶解在水溶性有机溶剂中，然后加入到水中，超声反应；将有机溶剂挥发除去，形成负载了聚集诱导发光化合物的纳米粒子；在纳米粒子水溶液中加入细胞穿透性多肽，反应后形成可高效染色细胞的聚集诱导发光纳米粒子。本发明的荧光粒子可用于干细胞长期分化示踪，尤其是小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程的示踪。与现有的商品化示踪试剂仅能示踪细胞分裂增殖6代相比具有更好的示踪效果，可追踪细胞分裂增殖超过12代。而且该聚集诱导发光纳米粒子具有高细胞染色效率，长期示踪能力，高光稳定性及低细胞毒性等优点。
【专利说明】
一种聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于医用材料领域，具体涉及一种聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和 在干细胞示踪中的用途，尤其涉及其在示踪小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中 的用途。
【背景技术】
[0002] 由外伤或疾病引起的骨损伤在临床上十分常见。传统临床治疗，主要是通过自体 骨移植实现修复。然而，骨移植治疗存在着许多缺陷，例如骨源有限、手术操作时间长、术后 易出现综合并发症等。
[0003] 近年来，干细胞疗法在骨修复中的应用日益引起人们的重视。例如，骨髓间充质干 细胞来源丰富、分化增殖能力强、可在体外大量培养、扩增和分化，在一定条件下可向成骨 细胞诱导，可作为骨组织修复的理想种子细胞。然而，在干细胞治疗过程中，需要长期监测 所植入干细胞的分布、增殖及分化情况，才能评估干细胞治疗的效果，进而改进干细胞的治 疗方式。
[0004] 已有一些成熟的干细胞示踪技术，包括核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像 (PET )、荧光成像等。相对于MRI和PET成像技术，荧光成像具有高分辨率、低成本、易于操作 等优点。
[0005] 现有的荧光示踪试剂主要包括荧光蛋白、荧光素酶、量子点、有机小分子染料等。 然而，荧光蛋白和荧光素酶需要基因转染，可能会干扰细胞的正常生理功能;量子点具有重 金属毒性，而且其焚光强度在细胞分化过程中急剧降低;传统的有机小分子染料的焚光具 有聚集诱导猝灭的缺陷，在高密度染色时，其荧光会发生明显的自我猝灭。因此，为了实现 对干细胞分化过程的长期荧光示踪，且不干扰干细胞的存活和分化能力，发展新型的荧光 示踪试剂显得十分必要。
[0006] 近年来，聚集诱导发光材料作为新一代荧光材料，在生物医学领域日益获得广泛 应用。聚集诱导发光材料具有强抗光漂白能力、高发光效率、大的斯托克位移和低毒性等优 点。由于分子内运动受限，AIE材料在聚集态具有高发光效率，因此很容易直接制备为高效 发光的纳米粒子。由于AIE纳米粒子可以通过修饰具有细胞穿透能力的多肽，实现对干细胞 的高效率染色标记，且具有细胞内保留能力强的优点，因此AIE纳米粒子在干细胞的长期示 踪应用中具有明显优势。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的在于提供一种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述方法制得的聚集诱导发光纳米粒子。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述的聚集诱导发光纳米粒子在干细胞示踪中的应 用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 一种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，是由聚集诱导发光化合物、两亲性聚合 物和细胞穿透性多肽制成，具体包括以下步骤：
[0012] (1)将式I所示的聚集诱导发光化合物和两亲性聚合物溶解在水溶性有机溶剂中， 室温超声下加入到水中，共超声l_5min;
[0013] 聚集诱导发光化合物与两亲性聚合物质量比为1: (1-5)，优选1:1;
[0014] 丄
[0015] 式I中，1^、1?2、1?3、1?4、1? 5、1?6、1?7、1?8、1?9可以全部相同或者全部不同，或者部分相同（比 如只有R 1、!?2、!?3为相同基团），可以是氢、羧基、取代或未取代的烷基；
[0016] 所述的烷基为直链或支链烷基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基或叔丁基；
[0017] 所述的两亲性聚合物具有生物相容性，是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酸酐、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-炔基或二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮中的一种以上，优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000-马来酸酐的混合物；
[0018] 所述的水溶性有机溶剂优选为四氢呋喃；
[0019] 所述的水优选蒸馏水；
[0020] (2)室温下搅拌或者往步骤（1)混合物的液面上吹氮气，使有机溶剂挥发除去，形 成负载了聚集诱导发光化合物的纳米粒子；
[0021] (3)在步骤（2)的纳米粒子水溶液中加入细胞穿透性多肽RKKRRQRRRC (SEQ ID No. 1)，室温下反应12-24小时，形成可高效染色细胞的聚集诱导发光纳米粒子；
[0022] 若所采用的两亲性的聚合物含羧基或氨基，则在加入细胞穿透性多肽之后还要加 入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺一起反应，以提 供偶联位点，促进多肽连接到纳米粒子上。
[0023] 由上述制得的聚集诱导发光纳米粒子可用于干细胞示踪，尤其用于干细胞向成骨 细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞和神经细胞分化过程中的示踪。
[0024] 本发明所述的聚集诱导发光纳米粒子是通过聚集诱导发光(AIE)实现干细胞长期 示踪成骨分化过程的。
[0025]在本发明中，"聚集诱导发光"或"AIE"是指荧光化合物在稀溶液中几乎不发光，但 在聚集态或固态发出强荧光的现象。"干细胞"是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞， 在一定条件下它可以分化成多种功能细胞。"示踪"是指通过成像显示干细胞在分化过程中 的位置及分布。
[0026] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0027] 1、本发明的AIE荧光粒子可用于干细胞长期分化示踪，尤其是小鼠骨髓间充质干 细胞向成骨细胞分化过程的示踪。与现有的商品化的C?iTacker?655示踪试剂仅能示踪细 胞分裂增殖6代相比，本发明AIE纳米粒子具有更好的示踪效果，可追踪细胞分裂增殖超过 12代。而且该AIE纳米粒子具有高细胞染色效率，长期示踪能力，高光稳定性及低细胞毒性 等优点。
[0028] 2、本发明的AIE荧光粒子可实现长期细胞示踪、对细胞存活率和分化能力无干扰、 尚发光效率、尚光稳定性、易于制备。
【附图说明】
[0029]图1是纳米粒子的粒径分布图和吸收发射光谱;其中，A是纳米粒子的粒径分布图， B是纳米粒子的紫外吸收图谱和荧光发射光谱。
[0030] 图2是实施例1制得的纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0031] 图3是小鼠骨髓间充质干细胞的染色照片；其中，A为明场图像，B为荧光图像，C为 叠加图像。
[0032] 图4是流式细胞仪检测结果图。
[0033]图5是纳米粒子的细胞毒性和光稳定性检测结果图;A是纳米粒子的细胞毒性测试 结果图，B是纳米粒子在小鼠骨髓间充质干细胞内的荧光强度变化图。
[0034] 图6是纳米粒子和qtracker?655对小鼠骨髓间充质干细胞的体外示踪效果图；其 中，A是纳米粒子的示踪效果，B是Qtmcker:li655的示踪效果，C是纳米粒子在不同传代次数 的小鼠骨髓间充质干细胞中的荧光染色效果图，D是Qtrackei>;655在不同传代次数的小鼠 骨髓间充质干细胞中的荧光染色效果图。
[0035] 图7是干细胞传代次数与两种标记粒子标记率的关系图。
[0036] 图8是纳米粒子对小鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石支架上成骨分化过程示踪 和成骨标志基因检测结果图；其中，A、C、E是小鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石支架上的 荧光图，B、D、F是用纳米粒子染色和未染色的小鼠骨髓间充质干细胞中骨桥蛋白、骨形态发 生蛋白_2、1型胶原、碱性磷酸酶的基因表达水平对比。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0038] 实施例1
[0039] -种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0040] (1)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000(lmg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇-2000-马来酸酐（lmg)、式I所示的化合物(R 1-!?9都为氢）（lmg)溶解在lmL四氢 呋喃中，在超声下(80%输出，SCIENTZ-II D超声仪)加入9mL蒸馏水中，继续超声2min，制得 表面修饰有马来酸酐的AIE纳米粒子。
[0041] (2)随后通过挥发除去四氢呋喃，进一步通过0.2μπι的过滤头过滤，除去沉淀及大 颗粒物质。向滤液中加入细胞穿透性多肽Tat(RKKRRQRRRC)(SEQ ID No.l)，在室温下反应 过夜后，通过透析除去过量的多肽，制成可用于细胞染色和示踪的AIE纳米粒子。
[0042]制得的纳米粒子在水溶液中的最大吸收在483nm，最大发射在645nm。量子产率为 23.5 %，纳米水合粒径为121.2nm(图1，PDI = 0.121)。透射电子显微镜(TEM)测得的纳米粒 径约为l〇〇nm(图2，Aex = 483nm)，这是由于其在干燥过程中的收缩效应造成的；且纳米粒子 表面通过修饰细胞穿透性多肽，可以实现对细胞的长期示踪，具有低毒性、高染色效率等优 点。图2中，虚线是纳米粒子在水溶液中的归一化紫外吸收图谱，实线是荧光发射光谱。 [0043] 实施例2
[0044] 一种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0045] (1)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000(lmg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇-2000-羧基（lmg)、式I所示的化合物(R3为叔丁基，其他取代基为氢）（lmg)溶 解在111^四氢呋喃中，在超声下(80%输出，5(：此犯'2-110超声仪)加入91^蒸馏水中，通过纳 米沉淀法直接制备表面修饰有马来酸酐的AIE纳米粒子。
[0046] (2)随后通过挥发除去四氢呋喃，进一步通过0.2μπι的过滤头过滤，除去沉淀及大 颗粒物质。向滤液中加入细胞穿透性多肽Tat(RKKRRQRRRC)(SEQ ID No.l)、69yg 1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和78yg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下反应过夜 后，通过透析除去过量的多肽，制成可用于细胞染色和示踪的AIE纳米粒子。
[0047] 实施例3
[0048] -种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0049] (1)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000(lmg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇-2000-氨基（lmg)、式I所示的化合物(R3为羧基，其他取代基为氢）（lmg)溶解 在lmL四氢呋喃中，在超声下(80%输出，SCIENTZ-II D超声仪)加入9mL蒸馏水中，通过纳米 沉淀法直接制备表面修饰有马来酸酐的AIE纳米粒子。
[0050] (2)随后通过挥发除去四氢呋喃，进一步通过0.2μπι的过滤头过滤，除去沉淀及大 颗粒物质。向滤液中加入细胞穿透性多肽Tat(RKKRRQRRRC)(SEQ ID No.l)、69yg 1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和78yg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温下反应过夜 后，通过透析除去过量的多肽，制成可用于细胞染色和示踪的AIE纳米粒子。
[0051 ] 实施例4
[0052] 小鼠骨髓间充质干细胞在37°C下与实施例1制得的AIE纳米粒子(50pM)在37°C下 孵育4h后，通过在荧光显微镜下的细胞成像（图3)和流式细胞仪检测（图4)，验证了细胞染 色效率达到100%。为了检测AIE纳米粒子的生物相容性，小鼠骨髓间充质干细胞与不同浓 度的AIE纳米粒子(0，12.5，25，50pM)共培养48h后，通过CCK8试剂盒检测细胞的存活率，发 现细胞存活率没有明显下降（图5A)。进一步，我们检测了 AIE纳米粒子的光稳定性。进入小 鼠骨髓间充质干细胞细胞的AIE纳米粒子，在488nm波长下（130W)连续光照5min，AIE纳米粒 子依然保持了很高的亮度，其荧光强度下降少于20% (图5B)。
[0053] 实施例5
[0054] 基于小鼠骨髓间充质干细胞，以商品化的Qtracker K:_655细胞示踪试剂为对照，对 AIE纳米粒子的体外长期示踪能力进行了评估(图4)。
[0055]用实施例1的AIE纳米粒子(50pM)和Qtmcker^SSUnM)标记的小鼠骨髓间充质 干细胞，分别传代培养至指定代数，然后通过荧光显微镜和流式细胞仪(统计7000个细胞） 对荧光信号进行分析。
[0056]如图6A和图7所示，当小鼠骨髓间充质干细胞被传代至第1、6和12代时，AIE纳米粒 子的染色效率分别为100%，96.7%，和35.3%。相对而言，Qtrackerκ'_655的染色效率分别为 90.2%，5· 36%，和0.35 % (图6Β和图7)。该结果表明ΑΙΕ纳米粒子的示踪能力明显比 Qtmcker?655强。该结论得到了荧光显微镜成像的进一步证实。例如，在相同的激发环境 下，AIE纳米粒子标记的细胞表现出比Qtmcker'hss标记的细胞更亮的荧光强度（图6C-D) 当小鼠骨髓间充质干细胞传代至第6代时，由于AIE纳米粒子的高染色效率和高亮度，其染 色的细胞，仍具有很强的荧光信号，而Qtrack：er?655染色的细胞仅有很微弱的荧光。
[0057] 实施例6
[0058] 羟基磷灰石与天然骨组织中的矿物质具有类似的组成，具有良好的生物相容性和 成骨诱导能力，因此羟基磷灰石支架被广泛用于修复骨缺损。基于具有良好生物相容性和 成骨诱导能力的羟基磷灰石支架，利用实施例1的AIE纳米粒子对小鼠骨髓间充质干细胞的 成骨分化过程进行了示踪研究。
[0059] 结果显示（图8A、C、E)，AIE纳米粒子标记的小鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石 支架上发出明亮的红色荧光，通过荧光显微镜检测，可连续追踪达14天之久，表明所述AIE 纳米粒子很容易进入细胞内且具有很好的细胞内停留能力。
[0060]发明人随后考察了 AIE纳米粒子是否会干扰小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化过 程。
[0061 ] 小鼠骨髓间充质干细胞以1 X 104密度培养在羟基磷灰石支架上（?9mmXd3mm)， 在成骨分化环境下培养至指定时间（3，7,14天）。不同样本（平行样本数为4)的RNA通过 HiPure Total RNA试剂盒分离。随后，RNA浓度通过NanoDrop2000光谱仪检测。生成的互补 cDNA随后通过PCR扩增及SYBR Green体系检测。目标基因的相对含量以GAPDH作为参比。目 标基因的表达水平通过方法进行测定。
[0062] 骨桥蛋白（0ΡΝ)、骨形态发生蛋白-2(ΒΜΡ-2)、Ι型胶原(Col I)、碱性磷酸酶(ALP) 是成骨分化过程的标志性基因，通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了在成骨分化 3、7、14天后的这些标志基因的表达水平。结果发现，未标记的和标记的小鼠骨髓间充质干 细胞在成骨分化过程中，其标志基因的表达水平相似(图8B、D、F)，表明AIE纳米粒子标记后 不影响干细胞向成骨细胞的分化过程。
[0063]针对目标基因的引物序列如下：
[0064] I型胶原
[0065] 正向：5，-CAGCCGCTTCACCTAGC-3，（SEQ ID Νο·2)
[0066] 反向：5，-TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC-3，（SEQ ID Νο·3)
[0067] 碱性磷酸酶
[0068] 正向：5，-TGCCTACTTGTGTGGCGTGAA-3，（SEQ ID Νο·4)
[0069] 反向：5，-TCACCCGAGTGGTAGTCACAATG-3，（SEQ ID Νο·5)
[0070] 骨桥蛋白
[0071] 正向：5'-TGCAAACACCGTTGTAACCAAAAGC-3'（SEQ ID Νο·6)
[0072] 反向：5'-TGCAGTGGCCGTTTGCATTTCT-3'（SEQ ID Νο·7)
[0073] 骨形态发生蛋白-2
[0074] 正向：5，-TGAGGATTAGCAGGTCTTTG-3，（SEQ ID Νο·8)
[0075] 反向：5'-CACAACCATGTCCTGATAAT-3'（SEQ ID Νο·9)
[0076] 参照基因GAPDH
[0077] 正向：5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'（SEQ ID No.10)
[0078] 反向：5，-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3，（SEQ ID No.ll)
[0079] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于包括W下步骤： (1) 将式I所示的聚集诱导发光化合物和两亲性聚合物溶解在水溶性有机溶剂中，室溫 超声下加入到水中，共超声l-5min;式I中，1?1、1?2、护心、1?5心、护、护、护全部相同、或者全部不同、或者部分相同，是氨、簇 基、取代或未取代的烷基； 所述的两亲性聚合物是二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酷基憐脂酷乙醇 胺-聚乙二醇-马来酸酢、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-簇基、二硬脂酷基憐脂酷乙 醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-烘基或二硬脂酷基憐脂酷乙醇 胺-聚乙二醇-叠氮中的一种W上； (2) 室溫下揽拌或者往步骤（1)混合物的液面上吹氮气，使有机溶剂挥发除去，形成负 载了聚集诱导发光化合物的纳米粒子； (3) 在步骤(2)的纳米粒子水溶液中加入细胞穿透性多肤RKKRRQRRRC，室溫下反应12- 24小时，形成可高效染色细胞的聚集诱导发光纳米粒子； 若所采用的两亲性聚合物含簇基或氨基，则在加入细胞穿透性多肤之后还要加入1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-径基硫代班巧酷亚胺一起反应，得到可高 效染色细胞的聚集诱导发光纳米粒子。2. 根据权利要求1所述的聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于:步骤(1)中， 聚集诱导发光化合物与两亲性聚合物质量比为1: (1-5)。3. 根据权利要求1所述的聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于:所述的烷基 为直链或支链烷基，为甲基、乙基、丙基、下基、异下基或叔下基。4. 根据权利要求1所述的聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于:所述的两亲 性聚合物为二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-2000和二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二 醇-2000-马来酸酢的混合物。5. 根据权利要求1所述的聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于:所述的水溶 性有机溶剂为四氨巧喃。6. -种聚集诱导发光纳米粒子，其特征在于：是由权利要求1-5任一项所述的方法制 得。7. 权利要求6所述的聚集诱导发光纳米粒子在干细胞示踪中的应用。8. 权利要求6所述的聚集诱导发光纳米粒子在干细胞向成骨细胞、软骨细胞、屯、肌细 胞、脂肪细胞和神经细胞分化过程中的示踪应用。
【文档编号】C09K11/07GK106085416SQ201610392534
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610392534.2, CN 106085416 A, CN 106085416A, CN 201610392534, CN-A-106085416, CN106085416 A, CN106085416A, CN201610392534, CN201610392534.2
【发明人】唐本忠, 高蒙, 赵祖金, 任力, 王迎军, 陈军建
【申请人】华南理工大学